随着CRISPR/Cas9技术的普及，单基因乃至单碱基的基因编辑已经逐渐成为实验室日常的技术体系。本文检验介绍如何使用最简单的方法对某一因进行基因敲除。
面将以小鼠Mafb基因为例进行操作示范。
首先第一步时进行基因序列的获取，使用UCSC基因组浏览器找到Mafb的基因，
观察所需的基因信息,该基因只有一个外显子，并且位于负链的基因（转录方向为反向）
由于CIRSPR敲除机制的限制，在这里我们需要在含有CDS的第一个外显子的CDS区设计sgRNA，并且不能跨外显子。我们首先需要将基因信息复制到本地，建议保存到snapgene中进行后续操作。获取基因的方法使用UCSC的get gene
并且设置将基因上下游1000bp的区域一并获取。
为了方便找寻基因区域，建议设置文字格式
得到如下效果
复制到snapgene中，并将序列进行翻转（view-flip sequence），将基因区域进行注释得到下面这样的注释信息
下一步对CDS区进行注释，使用NCBI 的基因组数据库找到Mafb基因
如果有多个蛋白亚型或者不同转录，都一并将信息手工添加到snapgene中
Mafb只有单一转录本和单一蛋白，下一步查找CDS区序列
在下方根据CDS、起始位置选择CDS序列
在Snapgene中注释后如下
选择CDS前200bp的序列进行sgRNA设计，如果CDS前200bp序列跨外显子，则需要分开设计
需要输入：1.name，2. email adress， 3. 序列类型，4.种属，5.序列
等待一会儿结果链接就会发送到邮箱
分析结果，选择最靠近5‘端及评分最高的sgRNA进行后续载体构建
这里选择了#1，#11，#13进行构建，sgRNA位置如下
载体构建：
使用pGL3-U6-gRNA载体构建sgRNA表达载体，在Bsa1酶切位点将sgRNA序列进行插入
所需合成的oligo 片段如下
上下游oligo 退火后将形成粘末端，可直接（不需要纯化）与Bas1酶切过的载体（胶回收纯化）进行连接。测序成功后可以用于敲除。
其他载体包括单质粒系统的构建于此相似，不再详细阐述。个人感觉双质粒系统敲除效率更高，Cas9蛋白与sgRNA表达质粒的转染比例建议为1:3。
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