上一篇关于PCR技术介绍到,PCR是通过一组序列特异性互补引物在酶促循环温度依赖的反应中扩增DNA的一种技术。而反向PCR(Inverse-PCR)只是常规PCR的一种变体。由霍华德·奥克曼(Howard Ochman)及其同事于1988年一同开发。
在我们深入探讨反向PCR之前,让我们先了解下常规PCR和反向PCR的基本区别。如下图,在常规PCR中,目标DNA是已知的,我们是拥有该序列的信息的。这取决于引物被设计为扩增已知的互补DNA序列。而在两个不同的单链上在反向PCR中,DNA区域未知,至于基因组中插入哪种类型的DNA,我们没有任何信息。我们设计的引物与已知的DNA区域互补,不是向彼此延伸,而是使DNA彼此远离。如下图,虽然两种PCR的Taq DNA聚合酶是相同的。在反向PCR中不需要特殊的DNA聚合酶。和DNA一样,引物是相互结合和合成的。借助已知DNA区域的序列信息,可以使用已知DNA序列特异性引物将DNA或插入的DNA的未知侧翼区域扩增到循环酶反应中。DNA合成发生在已知的DNA区域之外。限制性内切是对基因组DNA进行的,它只消化未知的侧翼区域,而不消化已知的DNA区域。连接未知DNA的侧翼区域会产生环状DNA,使用一组引物可以扩增该环状DNA。 选择要删除的区域,例如,点击某个“feature”反转所选区域,单击“编辑” → “反转选择(Invert Selection)”SnapGene支持自动选择引物,输入目标Tm,然后单击“选择引物(Choose Primers)”。在“ PCR”对话框中,查看引物名称和磷酸化状态。通过单击5'磷酸化复选框之一,将磷酸基添加到至少一个引物中。可以点击菜单中的“Creates Blunt Ends”选项进行验证。在你准备好模拟反向PCR时,输入扩增片段的名称,然后单击“PCR”。要循环化片段,单击“Actions”→“Circularize”...输入Circularized vector的名称,然后单击“Circularize” 要查看执行的步骤,可以切换到“历史记录”视图,非常方便。更多相关内容……