什么是TOPO®克隆技术？
TOPO®克隆（基于拓扑异构酶的克隆技术）不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。该技术依赖于互补的碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的基本能力来杂交并形成氢键。
TOPO®克隆有哪些优势
01
【高效】高达95%的克隆包含所需的插入
02
【快速】室温反应，仅5分钟
03
【轻松】简单的三步
04
【被证实】超过20,000的引用
05
【灵活】可提供有（或无）感受态细胞，并具有多种反应大小和格式，以适应你选择的聚合酶
*但同时也需要注意TOPO®克隆的缺点，只有很少的质粒骨架可用于TOPO®，并且自己创建TOPO®载体是不可行的。
简单三步实现TOPO®克隆
SnapGene如何模拟TOPO®克隆？
利用牛痘病毒拓扑异构酶I与3 '磷酸基共价结合的线性化载体，TOPO®克隆可以高效克隆PCR产物。SnapGene模拟了这种方法的三种不同变化，
TOPO®TA克隆（TOPO® TA cloning）使用线性化载体（Linearized Vectors，如pcDNA™3.4TOPO®）克隆3'-A突出端的PCR产物。这些PCR产物通常由Taq聚合酶产生；
Blunt TOPO®克隆（Blunt TOPO® cloning）使用线性化载体（例如pCR®-BluntII-TOPO®）来克隆具有平头突出端（Blunt Overhangs）的PCR产物。这些PCR产物通常由高保真聚合酶产生；
定向TOPO®克隆（Directional TOPO® cloning）使用线性化载体（例如pET200 /D-TOPO®）以定向方式克隆PCR产物
SnapGene通过自动化引物设计简化了TOPO®克隆。要设计TOPO®克隆过程，选择你想要扩增的DNA片段，然后从SnapGene软件中嵌入的列表中选择TOPO®克隆载体。然后，SnapGene将选择合适的引物
SnapGene可以模拟三种不同类型的TOPO®克隆。那么具体在SnapGene上如何操作呢？首先从定向TOPO®克隆开始，一起跟小编实际操作一下吧！
丰富资源库，自动引物设计
SnapGene提供所有商用TOPO®载体序列库，随时可以在SnapGene中使用。如果需要，SnapGene将自动设计适当的插入特异性引物，用于定向TOPO®克隆。
01
打开“TOPO定向克隆对话框”
操作：点击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆… 打开“定向TOPO®克隆”窗口。
02
选择插入(Insert)
操作：“插入(Insert)”选项卡 - “插入源(Source of Insert)”菜单 - “插入(Insert)”文件或 “浏览(Browse)”
*选择所选序列中将被扩增以进行定向TOPO®克隆的区域。单击“地图”或“序列”视图中的特征以将其选中，或切换到“序列(Sequence) ”视图以选择精确区域。单击“插入方向(Orientation of insert)”按钮以设置所需的插入方向。
Tips
如果你在打开并查看序列文件之前，单击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆…，开放序列会自动设置为“插入源(Source of Insert)”。
03
选择Vector
操作：切换到“线性化矢量(Linearized Vector)”选项卡，然后从“商业线性化(Commercial Linearized)”定向TOPO®矢量列表中选择要使用的矢量。
04
设计引物
操作：切换到“产物(Product)”选项卡，然后单击“选择PCR引物...”以设计新的插入特定PCR引物。
*确认将扩增正确的区域，设置所需的引物Tm，然后单击“选择引物”。
Tips
SnapGene将设计适当的正向和反向引物来扩增插入物。正向引物将包含确保定向TOPO®克隆所需的"5'-CACC"基序；
如果插入片段已经具有定向TOPO克隆所需的5' "CACC"基序，可以不要设计PCR引物。在这种情况下，在“插入”视图中，设置“插入源”，然后选择“直接用作模板(Use directly as the template)”。请注意，仅当序列中存在5' "CACC"主题时，“直接用作模板”选项才可用。
05
确认预测的插入序列和连接产物
操作：新设计的引物用来扩增插入序列。 正向引物将包含一个5' "CACC"基序，赋予TOPO®-mediated的插入物与载体连接的方向性。在“产物(Product)”选项卡中，切换到“序列”视图，并确认模拟的连接方向正确，并且在基于矢量的阅读框内。如果需要将核苷酸(nucleotides)插入正向或反向引物中以确保符合读框融合，请切换回“插入”面板并手动编辑引物序列。
最后不要忘记输入新序列的名称。
06
给新的引物命名
操作：切换到“插入”面板。编辑新设计的引物的名称。
07
创建载体/插入序列
操作：在“创建产品”字段中，输入产品名称。（注意，默认情况下，SnapGene将仅输出最终的圆形插入/向量乘积）
可选：可以选中“插入”的“制作文件(Make File)”选项，以为中间PCR产物创建单独的新文件。为插入PCR产物文件输入适当的名称。
Tips
SnapGene Directional TOPO®克隆工具可模拟PCR扩增和拓扑异构酶介导的连接步骤。你可以选择输出一个单独的文件来表示中间PCR产物
08
订购引物
单击顶部工具栏中的“保存”按钮下拉菜单，然后选择以分隔的文本格式导出引物数据...，然后可将其用于引物订购。
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