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SnapGene教程,Gibson Assembly®无缝克隆简述

什么是Gibson Assembly® 无缝克隆?



Gibson Assembly®是一种分子克隆方法,它允许在单个等温反应中连接多个DNA片段。它以其创建者Daniel G. Gibson的名字命名,后者是Codex DNA的首席技术官和联合创始人(维基百科,Gibson Assembly词条)。


它是一种不使用限制酶将片段插入质粒的常见方法。为了模拟这种方法,SnapGene可以提供一个直观的界面帮助科研人员了解整个克隆过程(如下图)。

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为什么选择Gibson Assembly® 


那么重点来了,Gibson Assembly®到底有什么优势呢?

简单来说,有以下几点:


01

无需特定的限制位点。 

可以连接几乎任何的两条片段,且无论顺序


02

无缝克隆,连接的片段之间无接缝


03

步骤更少,一管搞定


04

可一次连接多个DNA片段



与常规的限制酶/重组DNA克隆相比,这种DNA组装方法具备许多优势。


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  • PCR后DNA片段无需限制酶切消化。但主干载体可以被消化或通过PCR合成;

  • 与传统的克隆方案相比,它更便宜,更快,因为它需要的步骤和试剂更少;

  • 在两个DNA片段之间没有保留限制性位点的接缝,但是当DNA聚合酶闭合双链和垂悬端之间的缝隙时,这一区域稍微会容易发生突变;

  • 通过one-step主混合酶,在一个单管反应中可以同时连接多达5个DNA片段;

  • 通过two-step反应,最多可以同时合并15个片段。在two-step法中,首先进行核酸外切酶和退火步骤。然后在第二步中添加DNA聚合酶和连接酶;

  • Gibson Assembly®方法也可用于定向诱变(Site directed mutagenesis),以结合位点特异性突变,如插入,缺失和点突变;




SnapGene中的Gibson Assembly®


对于Gibson Assembly®,PCR扩增DNA片段以产生重叠末端。然后将扩增的产物与组装酶一起孵育,并将混合物转化为细菌。

SnapGene通过自动化引物设计简化了Gibson Assembly®过程。要计划Gibson Assembly®反应,只需选择你想要连接的DNA片段,SnapGene会自动化选择合适的引物来完成试验设计。

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