这一步之后可以反向（Edite-Invert）、可以调节对比度（Image-Adjust-Brightness/Contrast）、可以提高对比度（Process-Enhance Contrast），甚至可以在打开图像之后就将图像转变为HSB模式（一种和RGB、CMYK等并列的颜色模式），选择其中一个对比度比较大的通道（一般是亮度（Brightness）通道）进行复制，然后用于计数。这些辅助步骤都是为了使得被计数对象能够与背景区分更加明显，所以你在不同的教程里面会看到略有差异，当然如果比对明显，也可以什么都不做，比如本文用的例图就什么都不需要做。

2、Image-Adjust-Threshold，调节阈值（Threshold），默认采用红色蒙版代表选区，当然你也可以修改，但是没必要；

由于待测物体的颜色（灰阶值）相差很小，却与背景的灰阶值存在显著差异，通过所谓的阈值（Threshold）就可以设定待测物体灰阶值的上下限，来批量、自动地界定待测物体的选区。所以，如果待测物体与背景值灰阶值区分不大，或者待测对象灰阶值不均匀，则不能通过这种方法来进行自动选取。

下图红框左边表示能够自动识别选区的方法，一般使用Default（默认），右边表示蒙版的颜色或形式，默认红色就挺好；至于下面几个参数基本也用不到，默认就好；

默认的各种选区识别方法参数可能不尽人意，你可以使用上面两个滑块调节灰阶范围，同时观察图片中红色蒙版覆盖的物体，尽量将你需要计数的物体都盖进去。

3、点击Apply；会自动对图像进行二值化（Binary，简单地说是让图片“非黑即白”）处理，便于下一步统计；

4、有些细胞连在一起了，所以要把它们分开，计数成两个细胞；

image J本身提供一个所谓的“分水岭（Watershed）”法来分割细胞连接，Process-Binary-Watershed；这种方法对于规则细胞或规则物体是比较适用的，如果待计数物体不规则，就很容易出现分割错误。

下图白色分割线就是这个方法产生的效果：

5、点击Analyze-Analyze Particles，弹出如下界面；

左边三个框都勾选，分别表示展示分析结果、清除上一次分析的结果、以及本次结果的Summarize；如果在后续的分析中不需要用到刚刚采用阈值（Threshold）自动形成的选区，左边第四个框也不用勾选；右边第一个框表示排除边缘物体，也就是边缘的半个细胞要不要计数；右边第二个表示允许包括洞，为什么会有洞呢？如果待测物体灰阶值不均匀，比如某物体边缘黑中间白，那么就会形成一个洞，这个洞很显然不能算一个计数，可以勾选该选项去除。也有人会在第3步和第4步之间添加一个补洞步骤：Process-Binary-Fill Holes，这里没洞，就没做了。

最重要的是最上面可以通过Size（大小）和Circularity（圆度）来对要计数的对象进行筛除，比如本例图中有一些小黑点明显不是细胞，那么可以通过设定Size的下限来排除。

那如何获得正常细胞大小或者圆度的区间呢？一般是通过Wand Tool（魔棒工具）来选择并实际测量几个正常细胞，估计一下区间，然后把上下限值填入最上面的两个选框中。

下面的Show是结果展示形式，一般选择“Outline”就行，其他效果有兴趣的自己试一下。

6、最后会获得三个结果：Outline结果图，每个细胞有轮廓有计数；详细的Results列表；

Summary，从Summary可以看到计数结果（Count）为52，还有其他一些统计量。