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如何使用Image Pro Plus快速测量细胞划痕宽度?

细胞划痕实验可谓是性价比超高的一个小实验了。可以在不额外购买实验设备的情况下,一定程度地评价肿瘤细胞或者成纤维细胞的迁移能力


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在课题组经(Pin)费(Qiong)的限制下,这个实验成为很多老板的最爱。



细胞划痕实验本身的操作很简单,网上有很多教程,此处不赘述。当你辛辛苦苦拿到了下面这张照片时,说明你已经成功了一大半。


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接下来的工作就是测量,本文将以此为例,写出测量的图文教程。




1. 下载并安装Image Pro Plus。(站内搜索获取软件)



2. 点击File→Open,打开你需要测量的图片。


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3. 增强细胞划痕边界的信号,以提高IPP识别准确度。点击Process,点击过滤器Filters。


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4. 在Filters弹窗中,依次选择以下参数,需要做3步。


(4.1)在Edge选项下,选择Sobel。然后鼠标拖右侧的小窗口,将细胞划痕的边缘拖到这个窗口处,意在增强这个边界。

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点击Apply之后,可以看到目标图片已经发生改变,边界更加清晰了。


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(4.2)在Morphological选项下,选择Close。然后鼠标拖右侧的小窗口,使得细胞占满这个窗口。此步意在通过算法将细胞区域中的空隙都填充上颜色,以提高IPP的自动识别准确度。

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点击Apply之后,可以看到目标图片再次发生改变。

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(4.3)在Enhancement选项下,选择Lopass,选择5X5,然后鼠标拖右侧的小窗口,使得划痕边界处在这个窗口。此步骤意在调整划痕边界的平滑度。


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点击Apply之后,可以看到目标图片又一次发生改变。


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5. 增强图片的对比度。


(5.1)点击Enhance,选择Contrast Enhancement,调出下面的设置界面弹窗。

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(5.2)拉动图中的曲线,以获取合适的对比度。(当然你也可以点击弹窗中Save选项,保存这个对比度文件。后面测量其它图片时,到了这一步可以点击Load调出设置文件这种操作更有利于减小测量误差。


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6. 点击矩形工具,将图中的细胞宽度框选。如下图。


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7. 点击Measure中的count/size选项,弹框中点击measrue,再点击select measurement。测量参数选择Area和Box Height。调整Area最小测量值为1000,以便于过滤小面积区域。(注意:如果你的细胞划痕图像是横着的,那就要选择Box width)。点击OK。


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8. 最关键的一步。在manual模式下,点击select colors,进入选色界面。在HSI模式下通过调整0-255数值或拉动图中曲线,保证我们画的矩形选框中尽可能的被填满红色。


同样的,你可以点击弹窗中的File按钮来保存你的设置文件,测量其它图片时之间调用,以减小测量误差。完成后点击close。


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9. 在count/size界面选择Option,然后按照下图进行设置。最关键的是选择filled。完成后点击OK。


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10. 点击count,可以看到划痕区域被选择为多个测量区域,且存在一个最大测量区域被红色全部充满。这样的测量才是符合的。


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11. 点击View,查看数据。其中最大面积及其对应的高度值就是我们需要的数据。


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12. 细胞划痕宽度


细胞划痕平均宽度=细胞划痕最大测量面积 / 对应的长度


(eg,本例中细胞划痕最大的测量面积是1954623,对应长度为2531,那么细胞划痕平均宽度就是772.3)


13. 测量单位的问题


首先,你的所有图片应该是在同一倍数的镜下拍摄,一般10X。此时你采用IPP测量的宽度数值单位是“像素”,如果是多组间的比较,是否有单位对于组间比较无影响。


至于这个像素所代表的实际尺寸,则必须在该显微镜10X倍数下重新拍摄一个标尺,然后使用这个标尺进行像素与尺寸的换算,最终得到细胞划宽度的实际尺寸。


end



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