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实操 Image J 测量平均荧光强度

上期说到测量平均荧光强度,其实就是测量灰度值。


测量前还是想再交待一下,所有需要进行半定量分析的图像,一定要控制原始图像的质量。

一方面要精细地完成染色过程,背景荧光是引起测量误差的最大原因;另一方面,采集图像的过程也是很重要的。要点见文末链接

本文主要在于操作,以下图为例,测量胞浆蛋白(红色);测量软件为Image J。

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1. 由上图可以看到,被测量的图像为红色通道+DAPI形式,比较简单;而且背景很弱,说明染色效果较好,抗体特异性高。


测量思路:分割两个通道的图像,然后将红色通道荧光图像转换为8 bit 黑白图像;接下来在一定阈值下,测量平均灰度值,以此代表平均荧光强度。



2. 打开Image J,打开测量图像。然后点击Image,选择Color,选择Split Channels,分割通道。


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3. 操作后,原始图像会分成红、绿、蓝三个通道的8bit 黑白图像。这里我们要测量红色通道下平均荧光强度,因此,选择red即可。另外两张图像可以直接关掉。


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4. 接着点击Image,选择Adjust,选择Threshhold。这一步是手动选择阈值。

在弹窗的窗口中,如下设置,默认选择Default分割模式,选择Red,一定要勾选Dark background。


原则:保证所有的目标区域都被红色覆盖选中。


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5. 还有一种阈值模式,自动阈值法,即形成所有分割模式下的图像,自行选择最佳分割效果即可,分割原则同上第四条。点击Image,选择Adjust,选择Auto Threshhold,Try all模式下继续点击OK,得到如下形式。

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6. 设置测量参数。选择Analyze,然后选择Set Measurements,如下勾选。记住,一定要选择Limit to threshold,这样测量的才是被选择的目标区域,否则软件会默认计算全图。 点击OK。

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7. 按Ctrl+M快捷键,调出结果窗口,如下。其中Mean就是平均灰度值,也代表着这张图像上红色荧光的平均荧光强度。

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如果你要测量积分灰度值,那么在参数窗口选择Integrated density。结果窗口的IntDen就是结果。简单算一下就能看出,Area × Mean = IntDen。

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