2022年8月24日，来自瑞士苏黎世大学的Martin Jinek实验室在Nature发表题为R-loop formation and conformationalactivation mechanisms of Cas9的论文。文章利用冷冻电镜对CRISPR-Cas9系统R-loop形成的机制进行了全面系统的分析，并揭示了Cas9核酸酶活化的结构基础，这为降低脱靶改善CRISPR-Cas9系统的安全性提供了新的见解。
研究者指出，PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp便可保障CRISPR-Cas9系统形成稳定的R-loop结构。随后通过分析PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6、8、10、12、14bp时所形成的SpCas9-sgRNA-DNA复合物结构，研究者发现R-loop形成过程中构象变化最显著的结构域为REC2、REC3和HNH三大结构域。PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp时，sgRNA首先与互补的靶标DNA单链（简称为TS DNA）形成5bp的sgRNA-DNA杂合双链，更长杂合双链（>5 bp）的形成则被Cas9的Y450氨基酸阻碍。研究还发现，杂合双链与REC2结构域构象变化密切相关。PAM远端的DNA双链会被REC2/3结构域形成的正电缝隙锚定，其中REC2的多个位点（S219、T249和K263）可结合NTS DNA而REC3的多个位点（R586和T657）则结合TS DNA。此外，R-loop形成的初始阶段，NTS发生重定位并与RNA-TS DNA杂合链平行，而sgRNA的5’末端则位于HNH与PI结构域形成的正电缝隙中。PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为8bp时，Y450便难以阻挡>5bp的sgRNA-DNA杂合双链形成。此时REC2和REC3结构域的构象进一步改变，Cas9蛋白REC2及REC3的其它位点也会结合PAM远端的DNA双链。考虑到Y450在R-loop形成中的关键作用，研究者对Y450A突变后Cas9的脱靶风险进行分析。结果显示Y450A能显著降低Cas9对脱靶位点的切割速率从而提高其特异性。研究还指出，与包含PAM远端碱基错配的脱靶位点相比，包含sgRNA核心区（PAM近端10bp称为核心区）碱基错配的脱靶位点更难以形成稳定的R-loop结构，且受Y450A突变影响更大，脱靶风险更低。当sgRNA-DNA互补序列长度为10bp时，PAM远端的DNA双链会发生重定位，被REC3、RuvC和HNH结构域形成的正电中央结合通道锚定。此时，PAM远端的DNA双链会与sgRNA-TS DNA杂合链形成连续的碱基堆积，被sgRNA置换出的NTS DNA单链则位于HNH结构域下方并与RNA-TS DNA杂合链平行。更深入分析发现，PAM远端的DNA双链是楔入REC3、RuvC和HNH的 L1连接区中间，这也导致REC2结构域发生位移并掩蔽TS DNA的切割位点。REC2位移也导致REC2的负电螺旋区（简称DDD螺旋）与REC3的正电螺旋区（简称RRR螺旋）形成新的静电互作。研究还指出，REC2的DDD螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变能有效降低脱靶位点的体外切割效率，而REC3的RRR螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变只能降低包含sgRNA核心区错配的脱靶位点的切割效率。由此可知，REC2-REC3互作对R-loop形成过程中Cas9的结构重塑很重要。在sgRNA-DNA互补序列长度为6bp、8bp或10bp时，HNH核酸酶结构域被RuvC和PI结构域包裹，且活性区被掩蔽。R-loop区杂合链达到12bp时，REC2/3以及PAM远端的DNA双链构象保持稳定，但HNH结构域开始丢失稳定性。当R-loop区杂合链达到14bp乃至16bp时，HNH结构域发生明显位移并靠近sgRNA-TS DNA形成的杂合链区域。PAM远端的R-loop形成时，RuvC结构域的环状结构会重塑并与L2连接区互作，进而促进L2的位移和HNH的重定位，并导致中央结合区的关闭。不过此时HNH结构域仍处于失活状态。已知PAM远端4bp错配会抑制Cas9的酶切活性，而仅第19、20碱基有错配的位点则能被Cas9有效切割。当R-loop区杂合链达到18bp时（1mM Mg2+），HNH结构域仍处于与16bp R-loop相似的失活态，而REC2和REC3结构域则处于与12、14、16bp R-loop相似的构象，这与早前的报道一致。之后研究者对活化状态的Cas9-sgRNA-DNA复合物进行分析，发现其在TS和NTS的切割位点与已有报道一致。但与已有报道不同的是，新结果发现，NTS DNA单链切割后，PAM近端的NTS仍被RuvC活性位点结合，此时REC2发生位移并远离TS切割位点，HNH结构域则发生约140°旋转以切割TS DNA单链。以上的构象改变能被PAM远端的sgRNA-TS DNA杂合链弯曲及REC3重定位所促进。研究还指出，L1和L2连接区的重构导致了HNH旋转，最终导致NTS结合缝隙拓宽和RuvC活性区的暴露。综上可知，R-loop的形成与HNH结构域重定位以及RuvC活性区的暴露是偶联的，这也与已有的单分子研究吻合。总体而言，系统性的结构分析指出，CRISPR-Cas9活化过程中，R-loop的形成与核酸酶活化所必须的结构域重构之间存在多重偶联的关系。R-loop形成的初始阶段，REC2/3结构域可锚定靶位点DNA双链的末端，R-loop的中后期会促进REC2/3的重构及HNH核酸酶结构域的重定位，形成一种失活检查点的构象。R-loop达到完成态后会诱导HNH的活化，sgRNA-TS DNA杂合链的扭曲以及REC2/3重构。本研究厘清了Cas9活化的结构基础，也为CRISPR-Cas9基因编辑系统的深度优化提供了新的方向和思路。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05114-0
