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乔治·丘奇/刘陈立团队合作,迈出基因组重编码制备抗病毒人类细胞系的第一步

2022年8月2日,哈佛大学 George Church 教授团队、中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所刘陈立研究员团队合作在 Nature Communications 期刊发表了题为:Multiplex base editing to convert TAG into TAA codons in the human genome的研究论文。


研究利用多重复合的碱基编辑技术在人类基因组中将 TAG 转换为 TAA。该研究开启了人类全基因范围内 TAG 终止密码子转换为 TAA,初步证明了 TAG 转换为 TAA 在人类基因组中的可行性,同时创造了一次递送在人类基因组中数十个非重复位点同步碱基编辑的记录,为哺乳动物基因组的大规模工程化改造提供了一个工作框架。此外, GRIT 软件也可以被开发成一个新的计算机辅助设计(CAD)平台,用于设计编写大规模的基因组。


该研究迈出了基因组重编码制备抗多种天然病毒人类细胞系的第一步,为哺乳动物基因组多重复合编辑基因组编写(GP-write)路线图的制定奠定了基础。


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虽然读取 DNA 密码的技术不断进步,但科学家们编写 DNA 密码的能力仍然有限,这限制了其理解和操纵生物系统的能力。为了进一步了解生命蓝图,开发有助于大规模合成和编辑人类和其他物种基因组的工具和方法变得尤为重要。


因此,2016 年 Jeff Boeke 和 George Church 教授等提出了基因组编写计划(GP-write project),旨在从被动读取基因组转向主动编写基因组【1】,也被认为是人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的下一代基因组计划(HGP-write)


GP-write 计划将促进利用生物工程来解决人类面临的许多全球问题,如病毒感染、濒危物种增多,气候变暖等。随后,科学家们组建了由全球科学家们共同参与的工程生物学卓越中心(Center of Excellence for Engineering Biology: https://engineeringbiologycenter.org/),并于2018年提出了用基因组重编码来构建抗病毒人类细胞系,作为 GP-write 的第一个里程碑式的试点项目,该项目也被明确地限制在细胞和从细胞衍生的类器官中开展。


那如何通过基因组重编码制备抗病毒人类细胞系呢?


理论上,如果替换掉所有基因中的一个冗余密码子(或「重新编码」基因),并去除解码它的 tRNA,人类细胞仍然可以制造它所有的蛋白质。但病毒的基因仍然包含这个冗余密码子,并且依赖宿主细胞机制进行复制,这样病毒将无法将它们的基因转化为蛋白质,使得试图复制的病毒被消灭,因此,基因组重编码的细胞将具有了免疫力,这个概念已经在大肠杆菌中得到验证【2、3】


但这在人类细胞中是否能实现呢?


在本研究中作者提出了一个潜在方案来制备抗病毒人类细胞系:在全基因组范围内将终止密码子 TAG 转化为 TAA,并将内源性真核释放因子1(eRF1)替换为具有选择性通读的工程化 eRF1 突变体,使得人类细胞系具有抗病毒的能力(图1)


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图1、抗病毒细胞系制备示意图


地球上大多数生物体共用64个三联体密码子,其中61个密码子可以编码20种天然氨基酸和3个密码子作为终止信号。在20种氨基酸中有18个由一个以上的同义密码子来编码,这也被称为遗传密码子的简并性。基因组重新编码技术就是通过基因组工程手段进行同义密码子替换,将「冗余」密码子去掉,并赋予这些被去除密码子(「空白」密码子)新编码能力的技术。通过基因组重编码不仅可以赋予了生物体或细胞抗病毒的能力,也可以重新赋予「空白」密码子新的功能,包括非标准氨基酸的整合和生物防护。


2013年,George Church 实验室首次在大肠杆菌通过 TAA 取代 TAG 终止密码子并删除释放因子 1 (RF1),使得其具有抗病毒的能力【2】。2021 年,Jason Chin 实验室在大肠杆菌全基因组范围内实现用同义词密码子替换两个有义密码子和一个终止密码子,并删除相应的 tRNA 和释放因子,使得该大肠杆菌码子具有抗多种病毒和遗传编码非标准的氨基酸的能力【3】。此外,基因组重编码设计也正在酵母基因组 SC2.0 计划中实施【4】,但在人类全基因组范围内进行基因组重编码是否可行呢?


该研究中,研究人员首次提出了在人类全基因组范围内将 TAG 终止密码子转换为 TAAs 的工作框架(图2)。首先,作者们开发了一个软件 GRIT 来解析基因组数据,识别人类基因组中所有的 TAG 密码子,并为碱基编辑器设计 gRNAs,引导它们转换为同义密码子 TAA。虽然该软件只在人类基因组数据上进行了测试,但它可以用于其他具有高质量参考基因组和充分注释的真核生物,如小鼠和果蝇等。随后,他们开发了高效的 TAG 到 TAA 转换方法,通过多个 gRNA 阵列递送与 CBE 单碱基编辑器【5】及其报告荧光分子,使高编辑的细胞得到富集。


此外,作者们还通过单细胞 RNA 测序(scRNAseq)分析了细胞群体中单细胞中多重复合碱基编辑的结果。最后,他们通过全基因组测序、转录组测序和核型分析等手段对那些高基因组修饰的单克隆进行了评估。


0 (1).png图2、TAG 终止密码子转换为 TAA 的工作框架


人类基因组重编码是一个系统而复杂的基因组工程。虽然本研究可以通过一次转染在单个克隆中实现多达33个基因位点编辑,但这还远远不够。为了使以 TAG 作为终止密码子必需基因或全部的基因,都可以转换为 TAA,论文作者在文章的讨论部分,提出了几种可能的优化工作框架的策略:


1) 基于 CBE 变体、先导编辑器和 DdCBE 开发低脱靶、高编辑效率的新型碱基编辑器。

2) 增加 BAC 或 YAC 载体上的 gRNA 阵列和 sgRNA 池,提高 sgRNA 的递送能力。

3) 通过 RNP 和同步转染等新的递送方法(图3)

基因组重编码的人类细胞一旦完成,将提供一个独特的具有扩展功能的底盘细胞,可广泛应用于生物医学,特别是用于制造细胞疗法或治疗生产线,来抵抗大多数天然病毒的感染。

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图3、潜在优化 TAG 终止密码子转换为 TAA 工作流程的方法


哈佛大学 George Church 教授、中科院深圳先进院合成所刘陈立研究员与哈佛大学医学院 Eriona Hysolli 博士为共同通讯作者。中科院深圳先进院合成所陈宇庭博士(前哈佛医学院 Church lab 博士后研究员、现中科院深圳先进院合成所助理研究员与执行课题组组长)Eriona Hysolli 博士、陈安璐博士和 Stephen Casper 为共同第一作者。哈佛大学刘松雷博士和 Kevin Yang 等对论文的实验做出了重要贡献。该研究得到美国能源部、哈佛大学医学院、中国国家自然科学基金委、中国科学院和深圳市等多个项目支持。


论文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-022-31927-8


参考文献

1, Boeke, J.D. et al. GENOME ENGINEERING. The Genome Project-Write. Science 353, 126-127 (2016).

2, Lajoie, M.J. et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science 342, 357-360 (2013).

3, Robertson, W.E. et al. Sense codon reassignment enables viral resistance and encoded polymer synthesis. Science 372, 1057-+ (2021).

4, Richardson, S.M. et al. Design of a synthetic yeast genome. Science 355, 1040-1044 (2017).

5, Thuronyi, B.W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat Biotechnol 37, 1070-1079 (2019).


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