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诺奖得主 Jennifer 最新研究:CRISPR/Cas12c 无需切割 DNA 就可实现基因沉默,抵御病毒入侵

2022 年 6 月 2 日,诺奖得主 Jennifer A. Doudna 及其团队在 Molecular Cell 发表了题为 A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression 的研究文章,发现 Cas12c 是一种 RNA 引导的 DNA 结合酶,它不切割靶 DNA,而是通过 crRNA 介导的相互作用与靶 DNA 结合,并可以通过识别噬菌体必需基因来保护细菌免受噬菌体的感染


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图片来源:Molecular Cell



主要研究内容


Cas12c 可处理 pre-crRNA,但不切割 DNA


为了确认 Cas12c 是否具有发挥免疫保护功能的一系列酶活性,他们首先重组了 Cas12c 并对其进行了更详细的探索。结果发现,不像其他 Cas 酶可以直接结合重复序列的近端或内部,Cas12c 切割蛋白结合重复序列下游 17 个核苷酸的 pre-crRNA


接下来,他们借助多种底物检测了 Cas12c 切割 DNA/RNA 的能力,均发现 Cas12c 无法切割这些与导向 RNA 互补的底物。因此,这些结果表明 Cas12c 是 RNase(核糖核酸酶),而不是 DNase(脱氧核糖核酸酶),无法对 DNA 进行切割


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图片来源:Molecular Cell


Cas12c RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理


随后,研究人员推测 Cas12c 的 RuvC 核酸酶结构域是执行 pre-crRNA 加工的部位。与该假说一致的是,当将 RuvC 金属配位羧酸盐突变后,Cas12c 的 pre-crRNA 处理活性随即丧失。


为了验证 RuvC 结构域在 pre-crRNA 加工中的作用,他们评估了 Cas12c 加工 pre-crRNA 后产生的 RNA 产物的性质,结果发现处理后的 RNA 切割片段的电泳迁移率降低,这与金属离子依赖的催化机制一致,表明 Cas12c 的金属离子依赖的 RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理。不过,后续的更加深入的实验结果也表明 RuvC 结构域在 Cas12c 中的作用也仅为 pre-crRNA 的处理。


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图片来源:Molecular Cell


RNA 引导的 Cas12c 与 DNA 结合依赖于 pre-crRNA 的加工


上述的实验已经证明 Cas12c 不进行靶 DNA 切割,那么 Cas12c 是否能结合经由 RNA 引导的互补底物?结合筛选实验表明,Cas12c 在低纳米摩尔范围内可结合目标 dsDNA,并对部分碱基配对的 DNA 具有更强的亲和力。因此,这些数据表明,像其他 Cas12 酶和 Cas9 一样,Cas12c 也与目标 ssDNA 具有较高的结合亲和力但不能检测到与 ssRNA 结合


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图片来源:Molecular Cell


Cas12c 的 pre-crRNA 加工活性提示 crRNA 成熟可能对目标 dsDNA 结合至关重要。为了证实这一想法,他们测试了在 pre-crRNA 或成熟 crRNA 的介导下,Cas12c 的 DNA 结合亲和力。


结果发现,野生型 Cas12c 在每种情况下都能以相似的亲和力与目标 dsDNA 结合;然而,当 pre-crRNA 含有阻止 Cas12c 催化过程的硫代盐时,Cas12c 对 dsDNA 的结合作用有明显的减弱。因此,这些结果表明,CRISPR-Cas12c 系统的功能需要 pre-crRNA 的处理,如果没有 pre-crRNA 的处理,Cas12c 则无法有效地结合目标 dsDNA


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图片来源:Molecular Cell


Cas12c 可以在不触发 DNase 活性的情况下阻断基因表达


前期的研究发现,Cas12c 可以靶向细菌中生存必需的基因,这可能是由于体内 Cas12c 介导的基因组靶点的切割,也可能是 Cas12c 通过靶向聚合酶阻断反应来介导转录沉默。为了探索这些可能性,研究人员利用大肠杆菌开发了一种双色荧光干扰试验,其中编码红色荧光蛋白(RFP)或绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因被整合到大肠杆菌基因组中。


Cas12c 定向切割导致的染色体断裂对大肠杆菌是有毒的;相比之下,如果 Cas12c 结合但不切断靶 DNA,则会观察到基因靶向荧光团的损失而不导致细胞死亡。他们的实验结果表明,野生型 Cas12c 和 RuvC 失活的 dCas12c 在靶向 GFP 或 RFP 的 sgRNA 的引导下,可以沉默基因表达而不杀死细胞。因此,这些结果也与上述生化数据一致,即 Cas12c 是结合但不切割目标 DNA


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图片来源:Molecular Cell


天然 Cas12c 保护细胞免受噬菌体感染


在自然界中,CRISPR-Cas 系统被认为是通过 RNA 引导外源核酸的切割来保护原核生物免受病毒感染,而 dsDNase 活性是所有已知的 DNA 靶向 CRISPR 系统的关键功能。然而,Cas12c 没有可检测到的 DNase 活性,那么其是否也能够仅基于靶向 DNA 结合提供抗噬菌体免疫保护作用?


他们使用噬菌体空斑实验来回答了这一问题。结果与预期一致,他们的确观察到了野生型 Cas12c 具有独立于 DNA 链靶向的抗噬菌体活性


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图片来源:Molecular Cell


此外,与靶向非必需基因相比,Cas12c 与靶向噬菌体必需基因的 sgRNAs 配对,可以使斑块减少几千倍。有趣的是,RuvC 失活的 dCas12c 的结果与野生型 Cas12c 的结果类似,这表明噬菌体防御是独立于 RuvC 活性发生的


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图片来源:Molecular Cell



结语


在微生物的进化中,CRISPR-Cas 酶通过降解外源核酸为微生物提供免疫,可以保护细菌免受病毒侵害。在这项研究中,Jennifer A. Doudna 团队揭示 CRISPR-Cas12c 的一个重组 RuvC 结构域只切割 precrRNA,而不是目标 DNA,在不对入侵者进行化学攻击的情况下完成抗病毒干扰


此外,他们发现 Cas12c 的 RuvC 结构域只催化 pre-crRNA 的成熟,以介导 Cas12c 与靶向 DNA 结合进而发挥转录抑制的作用。同时,这种天然的不含 DNase 的 Cas12c 酶可以在针对噬菌体必需基因时保护细菌免受噬菌体感染。


总之,这些结果表明,即使在不具有 DNA 切割活性的情况下,CRISPR 系统也可以提供抗噬菌体免疫保护功能


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图片来源:Molecular Cell



参考文献

1. Huang et al., A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression, Molecular Cell (2022).

2. Knott, G.J., and Doudna, J.A. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science 361, 866–869.

3. Nussenzweig, P.M., and Marraffini, L.A. (2020). Molecular mechanisms of CRISPR-Cas immunity in bacteria. Annu. Rev. Genet. 54, 93–120.



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