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Nat Methods | 伊成器课题组开发胞嘧啶碱基编辑器全基因组脱靶效应检测的新工具

2021年6月7日,北大-清华生命科学联合中心、北京大学生命科学学院伊成器课题组在Nature Methods杂志发表了题为“Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors”的文章。研究人员巧妙地利用了CBE在进行靶向编辑过程中会产生中间产物脱氧尿嘧啶(dU)这一特点,对CBE产生的dU进行生物素(biotin)标记、富集;同时在dU位点的附近,将正常胞嘧啶C替换为d5fC,结合后续的化学标记反应【11-13】,产生串联C-to-T的信号从而增敏脱靶编辑的检测,开发了名为Detect-seq(dU-detection enabled by C to T transition during sequencing)的CBE脱靶检测技术。


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图- 2 Detect-seq实验流程示意图

研究人员首先在人胚肾细胞HEK293T和人乳腺癌细胞MCF-7转染BE4max,分别使用4种、2种不同的sgRNA对基因组靶向位点进行C-to-T的编辑;同时对这些样本中进行了Detect-seq检测。通过Detect-seq检测发现,除RNF2位点外,其它靶向位点均可以产生几十至数百个Cas9依赖型的脱靶位点。
 
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图- 3 在三种不同sgRNA样品中鉴定到的Cas依赖型的脱靶位点。其中蓝色圆圈代表脱靶位点(off-targets),红色方块代表靶向位点(on-target) EMX1 n=48,VEGFA_site_2 n=511, HEK293_site_4 n=245

随后,研究人员比较了由Detect-seq鉴定到的脱靶位点与之前研究报道的使用体外生化孵育Digenome-seq方法或基于Cas-OFFinder软件预测的脱靶位点。通过靶向扩增子测序的验证(targeted amplicon sequencing),由Detect-seq鉴定的脱靶位点均可以在验证实验中表现出显著高于背景的C-to-T的突变;而仅仅被体外生化孵育Digenome-seq方法或基于Cas-OFFinder软件预测到的脱靶位点,则没有表现出显著高于测序背景的C-to-T的突变。进一步的生物信息学分析则表明,Detect-seq鉴定到的脱靶位点显著富集于活跃转录的基因区、基因启动子区等开放染色质区域,与体外实验和计算机预测结果呈现了鲜明的对比。
 
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图- 4 Detect-seq技术与体外孵育检测技术Digenome-seq及预测软件Cas-OFFinder相比,鉴定到的位点富集于活跃转录区等染色质开放区域。

在Detect-seq之前,领域内常使用检测DNA双链断裂(DNA double strand breaks, DSBs)的技术(如GUIDE-seq,CIRCLE-seq等)检测由Cas蛋白核酸内切酶切割DNA双链造成的脱靶效应。并以此来替代CBE系统造成的脱靶效应。在文章中,研究人员也比较了Detect-seq与GUIDE-seq在三种sgRNA样品中鉴定到的Cas依赖型脱靶位点。结果发现,除EMX1位点外,剩余两个sgRNA样品中Detect-seq均检测出远多于GUIDE-seq的Cas依赖型脱靶位点。这提示了Cas蛋白的结合活性造成的脱靶与其核酸内切酶造成的脱靶可能不同。

有趣的是,研究人员基于Detect-seq技术还发现了两种新型的Cas依赖型的脱靶编辑:sgRNA结合区域外编辑(out-of-protospacer edit)及靶向链编辑(target-strand edit)
 
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图- 5 CBE介导的sgRNA结合区域外编辑与靶向链编辑 sgRNA结合区域使用阴影标出,IGV图中红色方块代表正链C-to-T突变,绿色方块代表反链C-to-T突变;图下半部分为该区域靶向扩增子测序结果。


sgRNA结合区域外编辑即C-to-T的编辑发生在sgRNA结合区域外;而靶向链编辑则是C-to-T编辑发生在sgRNA与DNA结合链。根据Detect-seq的结果,上述两种编辑普遍存在于Cas依赖型的脱靶位点的结合区域。值得一提的是,虽然RNF2位点未发现Cas依赖型的脱靶,但是在其靶向位点的靶向链发现了显著高于测序背景的C-to-T编辑。根据后续的机器学习计算结果,研究者认为sgRNA 5’端错配和PAM附近的错配可能是影响sgRNA结合区域外编辑和靶向链编辑的关键因素。
 
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图- 6 sgRNA结合区域外编辑与靶向链编辑模式图

随后,研究人员发现,除了上述Cas依赖型的脱靶位点,Detect-seq技术也可以在转染BE4max的样品中检测到一些信号明显较弱、删除sgRNA后依然存在,但删除脱氨酶后降低至背景水平的Cas非依赖型脱靶。对于上述位点进行生物信息学分析后发现,该种位点主要发生在TC motif中的C中,与之前报道的rAPOBEC偏好性相同【14】

Detect-seq技术为碱基编辑领域内提供了一种能够高灵敏、高特异、无偏好性地检测细胞内的CBE脱靶位点的方法。脱靶效应理解的加深,也将为阐明CBE的催化机制、优化改造更安全的CBE工具带来新的视角与可能。为了便于Detect-seq技术的使用,研究人员还为Detect-seq编写了配套的生物信息学分析软件(代码已上传至Github,详见论文Methods部分)

原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41592-021-01172-w


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