2021年4月15日，曲阜师范大学曹博课题组与美国麻省理工学院 Peter Dedon 课题组等合作，在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq 的研究论文。

该研究开发的AQRNA-seq（Absolute Quantification RNA-seq），克服了现有RNA-seq的不足，首次实现了细胞内RNA分子的高通量测序、绝对定量分析、表观修饰定位、代谢片段鉴定等全面组学分析，尤其是含有表观修饰的RNA分子；利用AQRNA-seq，从绝对定量的角度，成功描绘了结核分枝杆菌和人类癌细胞内RNA组的完整表达和代谢图谱。

AQRNA-seq提供了一套不同于传统方法的全新RNA建库策略，并精确定量分析所有关键环节（图1），最终实现了：1）对细胞内全局性RNA分子无偏差、高灵敏度捕捉；2）样品中所有小RNA的测序读数和拷贝数之间呈直接线性相关，从而对RNA分子绝对定量分析；3）克服RNA修饰对定量的干扰；4）精确定位RNA分子上的修饰位点。

图1  AQRNA-seq技术流程及RNA测序读数和拷贝数之间的直接线性关系

该研究进一步利用AQRNA-seq，针对tRNA因含有高度修饰而无法利用传统方法进行高通量定量分析的难题，完成了国际上第一个完整的tRNA及其衍生片段（tRNA-derived fragments, tRFs）绝对定量分析的代谢图谱：以结核分枝杆菌为研究对象，揭示了其在生长期和潜伏期转变过程中，tRNA表达谱及其表观修饰的动态变化规律；同时，还首次发现了该细菌在应激过程中产生的大量未知新型tRFs（图2）。

这一发现暗示tRNA和tRFs在结核分枝杆菌细胞周期中的重要调控功能，对特征性分子进行深入研究，将为肺结核的诊疗提供潜在RNA分子靶标。

图2 结核分枝杆菌进入潜伏期过程中tRNA表达谱及其表观修饰变化规律

该研究还从绝对定量的角度，解析了人类乳腺细胞在癌变发生不同阶段miRNA的变化规律（图3），发现了多个特征性miRNA分子，这些特征性miRNA分子为癌症诊疗研究提供了新型分子靶标；同时，AQRNA-seq揭示了已有研究中关于miRNA鉴定的误区：目前已知的多数miRNA异构体（isomers，'isomiRs'），即miRNA末端序列多样性并非天然存在，而是传统测序过程中的人为引入。

这一发现刷新了人们对miRNA群体的认知，为鉴定miRNA的多样性和复杂性提供了重要参考。

图3 人类乳腺细胞癌变过程中特征性miRNA以及人为引入的末端多样性。

AQRNA-seq已经通过国际PCT申请，并在美国、中国和欧洲获得专利授权，该技术的商业化试剂盒也在开发过程中，将推动RNA测序进入绝对定量新时期。

据悉，曹博教授课题组近期已经成功开发AQRNA-seq新版本（version 2.0），通过进一步设计并优化多个关键步骤，在绝对定量的基础上，实现了PCR dimer-free的建库技术。该版本可以与现有small RNA-seq技术通用，同时解决了必须通过胶回收除去PCR引物二聚体的繁琐步骤，突破了限制RNA建库全自动化的关键限制因素，有望发展成为RNA测序的新型通用平台。

近年来，曹博教授一直围绕表观遗传调控的组学研究这一生命科学前沿热点，通过开发新型分子生物学技术，应用于解决领域内关键科学难题。主要科研成果（第一/通讯作者）发表在 Nature Biotechnology、Nature Communications、Nucleic Acids Research、PNAS、Molecular Microbiology 等国际著名学术期刊上。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-00874-y