科研星球

细胞外囊泡递载circSCMH1促进啮齿类和非人灵长类脑卒中动物模型功能修复

2020年5月22日,来自东南大学医学院姚红红团队和中科院昆明动物研究所王建红副团队,在Circulation上发表了题为Extracellular Vesicle–Mediated Delivery of Circular RNA SCMH1 Promotes Functional Recovery in Rodent and Nonhuman Primate Ischemic Stroke Models的研究性论文,发现细胞外囊泡递载circSCMH1促进啮齿类和非人灵长类脑卒中动物模型功能修复,从环状RNA层面,揭示了缺血性脑损伤后神经功能修复的新机制。 

1.png


1 研究背景
脑卒中是导致成人永久残疾的主要原因,严重损害患者的生活质量。目前,最常用的治疗方式是,组织纤溶酶原激活物溶栓治疗,但是存在治疗窗口狭窄的问题,即使及时溶栓也可能无法阻止长期的神经功能缺损。因此,加快卒中的康复,仍然是一个迫切需要研究的领域。
环状RNA(circRNA)分子是一种内源性的,非编码的RNA分子,特点是反向剪接和形成共价闭合环状。已知多种circRNA分子在缺血性脑损伤中起作用。基于慢病毒的表达系统,已广泛用于circRNA的基础研究中,但是此类递送系统的安全性问题,限制了对circRNA潜在治疗作用的探索。
胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),是细胞释放的一种脂膜囊泡,直径为30-500nm,能携带蛋白,脂质和核酸,并且能够穿过血脑屏障。本文中,研究者通过构建携带circRNA的人工修饰的胞外囊泡,探索其在体内向大脑递送circRNA的潜力。

2 研究方法
使用circRNA芯片检测,从急性缺血性中风患者的血浆中筛选出环形RNA SCMH1(circSCMH1)。构建人工修饰的狂犬病病毒糖蛋白-circSCMH1-细胞外囊泡,选择性地将circSCMH1递送到大脑。使用尼氏染色检查梗死面积。在啮齿动物,和非人类灵长类动物缺血性中风模型中,均执行了行为任务,以评估运动功能。高尔基体染色和免疫染色检测神经可塑性和神经胶质激活。蛋白质组学分析,RNA测序数据结合转录谱分析,鉴定circSCMH1的下游靶标。

3 研究内容
1)急性缺血性脑卒中病人的circSCMH1水平降低
首先,研究者应用circRNA芯片筛选技术,从急性缺血性脑卒中(AIS)病人血浆样本,进行circRNA表达谱筛选,发现一个circSCMH1表达显著降低。进一步相关性分析发现,血浆中circSCMH1水平与中风程度相关,且与预后水平相关。 

2.png


2)构建靶向中枢的细胞外囊泡
接下来,为了研究circSCMH1在脑卒中病理过程中的作用,研究者构建了靶向大脑的细胞外囊泡circSCMH1-EV。具体过程是,用编码GNSTM-RVG-Lamp2b-HA的质粒和circSCMH1质粒转染了HEK293T,纯化出RVG-circSCMH1-EV囊泡,通过纳米颗粒分析,电子显微镜和Western blot方法进行验证。最后,为了表征尾静脉注射到小鼠体内的细胞外囊泡的组织分布,用DiI标记了RVG-circSCMH1-EV,证明了囊泡成功靶向脑组织。在大脑中,红色的DiI+颗粒成小簇存在,位于神经元细胞质内,或附着在神经元的细胞膜上。 

3.png


3)RVG-EV递送circSCHM1增强了脑卒中小鼠的功能恢复
接下来,研究者构建了光化学脑卒中小鼠模型,检测了RVG-circSCMH1-EV对功能恢复的影响。提前训练的小鼠静脉脑缺血手术24小时后,静脉注射RVG-circSCMH1-EV。第二天进行尼氏染色,第4-28天进行行为学检测。RVG-circSCMH1-EVs组小鼠较对照组小鼠,在脑缺血后,行为明显改善。结果表明在脑缺血后24小时,使用RVG-circSCMH1-EVs治疗可促进运动恢复。但是,尼氏染色显示在RVG-circSCMH1-EV组和对照组之间,梗死面积无显著差异。 

4.png

 
4)circSCMH1过表达,在体内和体外促进大脑可塑性
接下来,研究者研究了circSCMH1影响脑卒中后功能恢复的细胞机制。通过流式细胞技术对脑卒中小鼠和假手术对照小鼠的神经元,星形胶质细胞,小胶质细胞和内皮细胞进行分类。假手术小鼠,circSCMH1在神经元中含量最高。RVG-circSCMH1-EV治疗组,显著降低了假手术和脑卒中模型小鼠,神经元数量的降低。与行为改善结果一致,脑缺血手术后第28天,小鼠的脊柱数目,神经突分支,树突长度,梗死周围皮层神经元交叉点的数目,也显著减少,这些表型均能通过RVG-circSC-MH1-EV治疗被改善。

与在体发现相似,体外暴露于氧葡萄糖剥夺(OGD),导致皮质神经元树突棘的密度显著降低,且 MAP2(微管相关蛋白2)免疫反应性明显丧失,神经元长度减少。这些表型可被circSCMH1慢病毒感染改善

6.png


5)CircSCMH1减少胶质细胞活化和外周免疫细胞浸润
既然CircSCMH1可以改善中枢功能,它是否改变周围皮层的局部神经胶质和炎性激活呢?研究者发现RVG-circSCMH1-EV处理,显著降低了脑卒中小鼠梗死周围区的肿瘤坏死因子α,单核细胞趋化蛋白1,白细胞介素1β,白细胞介素6的水平。中风后第3天的梗死周围皮层中,RVG-circSCMH1-EVs显著降低了星形胶质和小胶质细胞的反应性。此外,通过定量检测免疫细胞,发现脑卒中后,RVG-circSCMH1-EV可以抑制外周细胞浸润

7.png

 
6)CircSCMH1与MeCP2蛋白结合
接下来,为了进一步探索神经元可塑性的分子机制,在过表达circSCMH1的原代皮层神经元中,进行了转录组分析和蛋白质组学筛选。在筛选的差异表达蛋白中,使用人和小鼠转录调控数据库TRRUST,确定了2个上调的蛋白质(PHF2和SIN3A)和3个下调的蛋白质(MeCP2,TRP53BP1和MAZ), 可以调控15个差异表达的基因,其中9个之前报道是MeCP2靶基因。进一步实验表明,circSCMH1可以通过与MeCP2结合,抑制MeCP2入核,进而促进MeCP2下游靶基因Mobp、Igfbp3、Fxyd1和Prodh等基因的表达。

8.png


7)CircSCMH1促进恒河猴脑卒中后的运动功能恢复
最后,为了进一步探索circSCMH1的功效,研究者在非人灵长类动物中建立了光化学脑卒中模型,证实circSCMH1-EVs可显著改善脑卒中恒河猕猴的神经功能损伤程度并促进运动功能恢复。 

9.png

 

4 行文思路 

10.png


5 总结
本文开发了一种基于工程化细胞外囊泡,成功地将中风患者相关的circSCMH1递载到大脑的新技术,并证明circSCMH1显著改善了中风后的功能恢复,并增强了神经可塑性,抑制神经胶质反应性,及周围免疫细胞浸润。机制上,circSCMH1与MeCP2结合,从而解除了MeCP2对下游靶基因的抑制。为环状RNA的中枢靶向递送研究提供了新思路,为治疗缺血性脑卒中的新药研发提供了新靶点。

6 文章解析
2013年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼以及德国科学家托马斯·祖德霍夫,以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制,引起了细胞外囊泡(EVs)的研究热潮,尤其近几年外泌体成为科研热点。
EVs是指在生理和病理状态下,机体内细胞通过胞吞作用形成多泡小体后,通过细胞膜融合分泌到细胞外环境中的微小囊泡。根据囊泡直径大小,可将EVs分为三类:凋亡小体(>1000nm)、微囊泡(100~1000nm)、外泌体(30~100 nm)。

EVs的分离纯化方法:目前较成熟的EVs包括超速离心、免疫沉淀或亲和纯化、超滤法、尺寸排阻等。实际情况下应结合实验对EVs的纯度和浓度要求进行选择。
EVs形态学常用检测方法:透射电子显微镜、动态光散射、纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight)、Western blot、流式分析技术等。其中透射电子显微镜技术可直接观察EVs形态,动态光散射和Nanosight可反映EVs的粒径分布,Nanosight可直接检测EVs的浓度,Western blot实验仅能对EVs进行定性。 

研究热点方向:在疾病诊断方面,随着技术的完善,EVs成分及功能的研究越发成熟,EVs研究越发火热。但目前EVs的临床应用研究较少,有待挖掘EVs在辅助疾病诊断和预后监测的潜力将EVs从实验室中的差异表达物质,转化为临床上的成熟诊断标志物,是目前重要研究方向之一。


QQ客服
电子邮箱
淘宝官店
没有账号?