过氧亚硝酸阴离子（ONOO−）是生物体内的一种强氧化剂。它被称作超级自由基，可以调节多种生物过程。通常来说，ONOO− 的产生来源于一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O2−•）的反应。已有研究表明，ONOO− 具有强氧化性，并且在生物体内可以造成蛋白质结构破坏、DNA双链损伤、膜结构破坏、和线粒体损伤。因此，ONOO− 的产生介导多种疾病和衰老。此外，ONOO−介导的酪氨酸硝基化，对于细胞信号转到起着重要作用。因此，揭示ONOO−生物学功能对进一步解读生物体氧化/硝化过程和功能都具有重要作用。但是，由于ONOO−在生物体中半衰期极短，反应性强，特异性差，准确而实时探测ONOO− 成为揭示其生物学功能和病理机制的一大障碍。2021年2月12日，来自于弗吉尼亚大学（University of Virginia）的艾辉旺（Huiwang Ai）课题组在Cell Chemical Biology杂志上发表了文章A high-performance genetically encoded fluorescent biosensor for imaging physiological peroxynitrite，报道了全新的过氧亚硝酸阴离子检测荧光探针—pnGFP-Ultra。
通过结合基因编码和蛋白质工程技术， 研究人员在环化荧光蛋白生色团引入非天然氨基酸p-boronophenylalanine（BoF），实现了对生物体ONOO− 的实时检测。利用BoF与绿色荧光蛋白（GFP）生色团结合，绿色荧光蛋白生色团首先被淬灭。当存在ONOO− 时，ONOO− 会氧化BoF修饰后的生色团，从而解除对生色团的淬灭作用。重要的是，该系统对 ONOO− 具有最高110倍变化反应。pnGFP-Ultra对ONOO−有超高的特异性。生理浓度下的其他氧化性小分子，比如超氧阴离子（O2•−）、羟基自由基（•HO）、过氧化氢（H2O2）、有机过氧化物（HOOtBu）都不引起pnGFP-Ultra明显的荧光变化。利用这一生物传感系统，该课题组检测了巨噬细胞在激活状态下产生的ONOO−。同时揭示了小鼠原代胶质细胞在β-淀粉样蛋白刺激下产生ONOO−，并且表明米诺环素等化合物可以抑制小鼠原代胶质细胞在β-淀粉样蛋白存在时ONOO−的升高。
pnGFP-Ultra不仅本身是一种高效检测活细胞和组织内ONOO−的生物分析化学工具，也表明蛋白质，特别是环化荧光蛋白，可以作为一种有效的载体调控化学反应的活性。这一发现预期会促进新型荧光探针的发展，甚至通过定向进化发展出非天然的蛋白催化剂。另外，这一工作也改进了在活细胞中将非天然氨基酸定点引入蛋白质的手段。相对于传统方法，新方法提高了13倍的效率。pnGFP-Ultra和相关的用于将非天然氨基酸定点引入蛋白质的相关质粒现已上传到Addgene （http://www.addgene.org/Huiwang_Ai/）。https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(21)00013-1
