日期：2021/01/11 

杂志：Nature Methods 
杂志影响因子：30.822 
原文标题：Deciphering molecular interactions by proximity labeling 
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01010-5 
来源：美国Stanford University

摘要

传统观点认为，酶具有专一性催化功能，近年来生物信息与实验分析都证实了酶具有混杂催化功能，而且是普遍存在都现象。酶具有混杂催化活性是生物适应环境的基础，为适应环境，生物体内的酶将处于不断演化状态。具有混杂活性很可能是酶蛋白的共性特征。按照催化反应类型，酶可分为六类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶，对应于国际酶学委员会编号EC 1~6。进化生物学家推测每个酶蛋白可能催化10种以上都反应。

许多生物过程是通过蛋白质和核酸的分子相互作用来执行和调节的。邻近标记（PL）是一种通过遗传融合到混杂的酶来标记特定蛋白质“诱饵”的内源性相互作用的一种技术，所述混杂酶催化活细胞中可扩散反应的产生。然后可以通过质谱或核酸测序富集和鉴定与诱饵相互作用的标记分子。在这里回顾PL技术的发展，并重点介绍将PL应用于分子相互作用的发现和分析的研究。特别是专注于利用PL绘制活细胞和生物体中蛋白质-蛋白质，蛋白质-RNA和蛋白质-DNA相互作用的图谱。

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions, PPIs)是细胞生命活动的基础。传统的体内蛋白质相互作用捕获技术如亲和纯化-质谱技术(AP-MS)，不能有效地捕获瞬时的或较弱的蛋白相互作用，也不适用于低丰度的蛋白或疏水性较强的膜蛋白，且无法分辨蛋白相互作用发生的细胞区室化信息，存在较多的限制。然而，许多重要的信号转导蛋白如受体激酶以及细胞谱系发生的驱动因子往往具有上述特征，这极大地限制了我们对于细胞活动精细调控过程的认识。邻近标记(Proximity labeling, PL)的原理是将一个具有邻近标记功能的酶与目标蛋白融合，通过酶催化的共价修饰将邻近的蛋白标记上生物素，最后通过亲和素磁珠富集生物素标记蛋白进行质谱鉴定。邻近标记技术不依赖于目标蛋白本身的性质以及蛋白质相互作用的强度，能够捕获传统的AP-MS无法鉴定的蛋白质相互作用。

内容

基于抗体的亲和纯化与基于质谱的蛋白质组学相结合，可以鉴定特定目标蛋白质的稳定相互作用伴侣。这些努力扩大了我们对包括酵母，果蝇和人类细胞在内的各种系统中蛋白质相互作用网络的理解。亲和纯化也可以与交联和核酸测序结合使用，以检验蛋白质-核酸相互作用，例如染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）。然而，亲和纯化的主要局限性在于，在细胞裂解和随后的洗涤步骤中，通常会失去弱或短暂的相互作用。为了克服这个问题，可以将亲和纯化与交联结合使用。但是，这会增加误报率。此外，将亲和纯化应用于缺乏高亲和力抗体的不溶性靶标或蛋白诱饵更具有挑战性。

PPI 是各种细胞过程的基础。识别PPI的传统方法包括酵母-双杂交（Y2H）筛查和免疫沉淀，加上质谱（IP-MS）。酵母双杂交和其他蛋白质互补测定法代表了另一种在活细胞中定位蛋白质-蛋白质，蛋白质-RNA和蛋白质-DNA相互作用的方法。 这些方法通常具有很高的通量，可以筛选成千上万的潜在分子相互作用。 但是，许多蛋白质互补测定法均具有细胞类型和细胞器类型限制（例如，酵母双杂交不适用于膜蛋白）。

邻近标记（PL）的开发旨在为活细胞中分子相互作用这些传统方法提供替代补充。 PL使用经过工程改造的酶，例如过氧化物酶（经改造的抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2），辣根过氧化物酶（HRP））或生物素连接酶（BioID，BioID2，BASU，TurboID，miniTurbo）。 PL酶将惰性的小分子底物转化为短暂的反应性物质，从酶活性位点扩散出去以共价标记邻近的内生物种（图1a，b）。标记半径取决于反应性物种的半衰期和环境中猝灭剂的浓度，例如针对APEX的谷胱甘肽和针对BioID和TurboID的胺。通过实验确定的活细胞中HRP，APEX，BioID和TurboID酶的标记半径范围为1-10 nm。但是，将半径固定在PL酶上的反应物浓度最高，并从源头处逐纳米下降，而不是固定半径，而是将PL酶标记为“轮廓图”更为准确。过氧化物酶和生物素连接酶产生的反应性物质也是膜不渗透性的。底物分子通常包含生物素手柄，以使链霉亲和素珠能够随后富集标记物种，并通过质谱（对于蛋白质）或核酸测序（对于RNA）进行鉴定（图1c）。根据PL酶的定位和表达，PL可用于在几种不同的长度尺度上询问空间蛋白质组-从整个细胞20到细胞器和亚细胞区室到大分子复合物。

接近标记，用于分析蛋白质间相互作用

邻近标记已应用于广泛的PPI定位问题，从信号转导网络（促分裂原相关蛋白激酶（MAPK），肾上腺素，G蛋白偶联受体（GPCR））到酶–底物相互作用（E3泛素连接酶，激酶）。这些研究已经在多种细胞类型（例如2D或3D培养物，内皮细胞，神经元细胞）和生物体（细菌，酵母，果蝇，蠕虫，植物，小鼠和人类组织）进行过应用。

每种过氧化物酶都具有不同的底物，生物素酚（biotin-phenol ）是APEX的一种底物。当研究人员将生物素酚添加到表达APEX的工程细胞上时，该酶生成了生物素-苯氧自由基(phenoxyl radical)——带有不成对电子的高活性分子。这些自由基迅速抓取附近的蛋白质，用生物素对它们进行标记。

图1 

细胞内的各种复杂生理活动、细胞对外界环境的反应，都以蛋白质之间的相互作用为纽带，形成复杂信号转导网络系统。蛋白质相互作用包括形成较稳定的蛋白质复合物或瞬时相互作用两类。一些蛋白质之间的瞬时相互作用有重要的生理功能，但是由于比较微弱，常规方法难以检测。近年来，临近标记技术正在被逐渐应用到蛋白质相互作用的研究中。其原理是在已知蛋白上融合一个具有临近标记功能的酶，通过酶介导的蛋白质共价修饰将与已知蛋白相互作用的蛋白标记上生物素，从而使原本不易被检测的相互作用蛋白被发现和鉴定。但是目前临近标记技术常用的两个酶都有比较大的局限性：BioID方法应用的biotin ligase（生物素连接酶）突变体的活性不够高，而APEX方法应用的peroxidase（过氧化酶）需要在反应体系里添加过氧化氢。使用工程抗坏血球过氧化物酶（APEX）或大肠杆菌生物丁加体比拉（称为BioID）的接近标记（PL）技术已成功用于识别哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。然而，基于APEX的PL对过氧化氢（H2O2）的要求、生物素（16~24小时）的孵育时间较长，以及基于BioID的PL的孵育温度（37°C）较高，严重限制了其在植物中的应用。最近描述的基于 TurboID 的 PL 解决了 BioID 和 APEX 的许多限制。TurboID 允许在室温（RT） 条件下只需 10 分钟即可快速贴贴蛋白质标签。TurboID 的效用已在动物模型中得到证明。尽管生物素连接酶（例如BioID和TurboID）已成功用于许多生物体中的体内蛋白质组学定位，但进一步的优化（例如使用非生物素探针避免内源性生物素化蛋白质的背景）可能会改善体内PL的相容性。

总结

细胞功能受蛋白质，核酸及其相互作用（包括蛋白质与蛋白质的相互作用（PPI），蛋白质与RNA的相互作用以及蛋白质与DNA的相互作用）严格调节。 这种分子相互作用网络是大多数生物过程的核心，而其失调与多种人类疾病有关，包括癌症，免疫疾病和神经退行性疾病。 大规模发现活细胞中分子相互作用的方法可以为生物学探索和治疗干预提供见识。