内质网 (endoplasmic reticulum) 是细胞内面积最广的细胞器，内质网膜占据了细胞内大约60%的生物膜【1】。内质网可以被分成三个区域，并具有不同的形态和功能：核染色质周围的核膜 (nuclear envelope)；铺满核糖体的片状内质网 (ER sheets)，是分泌蛋白或膜蛋白进入分泌系统或插入膜的部位；以及管状内质网 (ER tubules)，其功能是调节脂质和离子稳态以及细胞器运输、分裂及融合【1,2】。管状内质网可以与其他细胞器形成膜接触位点 (membrane contact sites)，这些膜接触位点可以使两个正在接触的细胞器沿着微管一起移动【2】。管状内质网可以和所有已知膜性细胞器形成膜接触位点，甚至可以与无膜细胞器形成接触位点【3】。内体 (endosomes) 就是其中一个可以与管状内质网形成膜接触位点的细胞器。内体-内质网膜接触位点有许多功能：包括了调节内体的运输，脂稳态以及内体分裂和内体中货物的分选。这些功能对调节细胞信号通路，脂类代谢等过程都起到至关重要的作用，而这些功能失常会造成许多严重的疾病【4】。内体-管状内质网膜接触位点的其中一个特点是随着内体成熟，这些膜接触位点的数量会增加【5】。而目前人们并不知道为什么这些膜接触位点的数量要增加，以及这些增加的膜接触位点的功能是什么。近日，来自美国科罗拉多大学波尔德分校以及霍华德·休斯医学研究所 (HHMI) 的Gia Voeltz教授及其博士研究生吴昊肸（xī）在Developmental Cell发表研究 Reticulon-3 Promotes Endosome Maturation at ER Membrane Contact Sites 。该研究通过高分辨率活细胞动态成像发现了一对新的内体-内质网膜接触位点蛋白：Reticulon-3和Rab9a，并证明此膜接触位点的功能室促进内体成熟【6】。
为了找到新的管状内质网膜接触位点蛋白，研究者首先将精力集中在了管状内质网膜蛋白上。早在2006年，Gia Voeltz教授在哈佛医学院Tom Rapoport实验室进行博士后研究期间，找到了一类只在管状内质网上的蛋白叫reticulons (Rtns)，并且找到其中一个家族成员Rtn4a的主要功能是管状内质网的形态发生【7】。而动物细胞里有四个reituclons，这些reticulons的膜结构域非常保守，而细胞质结构域的序列则不保守，除了Rtn4a之外，我们并不了解其他三个reticulons的功能。研究者假设其他reticulons可能可以通过其不保守的细胞质结构域执行不同的功能。因此，研究者分析了另外一个Rtn家族成员Reticulon-3L (Rtn3L) 的功能。首先，研究者测试了Rtn3L是否与Rtn4a的功能一样。通过CRISPR-Cas9基因敲除来分析两个蛋白对内质网形态的影响，研究者得出了两个蛋白的功能并不一样的结论。研究者之后分析的了Rtn3L的在管状内质网上的定位，并发现Rtn3L并不像Rtn4a一样覆盖整个管状内质网，而是集中在特定的位点。研究者继而用高分辨率活细胞动态成像分析了这些Rtn3L位点，并发现这些位点大多是晚期内吞通路和内质网的膜接触位点。因此，研究者分析了不同内吞通路的标记蛋白，发现了Rtn3L在早期内体 (early endosome) 以及晚期内体 (late endosome) 的转换时期被募集到内体上。并找到了募集Rtn3L到内体上的蛋白Rab9a。之后，研究者通过结构功能分析找到了Rab9a通过一个FSV序列结合Rtn3L的6个LIR (LC3-interacting region) 序列来募集Rtn3L。通过基因沉默以及生物化学的分析，研究者证明了Rab9a在此通路的上游募集Rtn3L到内体上形成这个内体-内质网膜接触位点。之后，研究者测试了这对新发现的膜接触位点蛋白的功能，并发现Rab9a-Rtn3L膜接触位点的功能是调节内体成熟。通过基因沉默以及敲除的手段，研究者发现了在细胞敲除Rtn3L或者Rtn3L/Rab9a的表达量降低时，内体可以被内吞但不能正常地从早期转化为晚期内体。而因为对内体成熟的调节，研究者发现了在细胞敲除Rtn3L或者Rtn3L/Rab9a的表达量降低时内体货物分选过程也不能正常工作。总的来说，该研究找到了一对全新的内体-内质网膜接触位点蛋白，并且发现了他们的功能是调节内体成熟。该研究建立了管状内质网膜蛋白 (比如reticulons) 的工作模型：用它们独特的膜结构域集中在管状内质网上，同时通过朝向细胞质的结构域来发挥功能。许多其他管状内质网膜蛋白都符合这个工作模型。最后，该研究的结构功能分析揭示了一个可能的信号通路调节的方式。Rtn3L的LIR序列可以在正常情况下结合Rab9a的FSV序列，而在细胞长期饥饿的情况下Rtn3L可以结合LC3的一个相似序列 (FLV)【8】，从而降解内质网。通过Rtn3L的LIR序列结合不同的蛋白，可以反映细胞的不同的代谢状态，进而有效地促进此蛋白的功能，这也反映出管状内质网膜接触点的功能多样性。https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.0141.Westrate, L. M., Lee, J. E., Prinz, W. A. & Voeltz, G. K. Form follows function: the importance of endoplasmic reticulum shape. Annu. Rev. Biochem. 84, 791–811 (2015).2.Wu, H., Carvalho, P. & Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science 361, eaan5835 (2018).3.Lee, J. E., Cathey, P. I., Wu, H., Parker, R. & Voeltz, G. K. Endoplasmic reticulum contact sites regulate the dynamics of membraneless organelles. Science 367, eaay7108 (2020).4.Huotari, J. & Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481–3500 (2011).5.Friedman, J. R., Dibenedetto, J. R., West, M., Rowland, A. A. & Voeltz, G. K. Endoplasmic reticulum-endosome contact increases as endosomes traffic and mature. Mol. Biol. Cell 24, 1030–40 (2013).6.Wu, H. & Voeltz, G. K. Reticulon-3 Promotes Endosome Maturation at ER Membrane Contact Sites. Dev. Cell 56, 52-66.e7 (2021).7.Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M. & Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell 124, 573–86 (2006).8.Grumati, P. et al. Full length RTN3 regulates turnover of tubular endoplasmic reticulum via selective autophagy. eLife 6, e25555 (2017).
