细胞产生大量的蛋白质复合物，这些复合物参与调节几乎所有的生物功能。例如，最近在后生动物的全蛋白质组研究中发现了1000种不同的多蛋白复合物【1】，而这个数字可能也是被低估的。随着越来越敏感的蛋白质组学和电子显微镜技术，蛋白质复合物的鉴定和结构表征正在迅速加快，使得接近自然条件下的高通量分析成为可能。与此相比，由于缺乏合适的高通量方法，绝大多数蛋白质复合物的生物发生和动力学的表征较差。经典的体外重组策略虽然在破译蛋白质复合物的功能方面非常成功，但一次通常只适用于少数蛋白质。另一方面，自上而下的遗传方法在识别相关的分子参与者方面具有强大的能力，但不能从引入变化导致的间接结果中辨别直接影响。即使将这些策略结合在一起，也无法轻松解决一些关键问题，如组装动力学或结构成熟过程的顺序。核孔复合物（NPC）是真核细胞中最复杂的蛋白质结构之一，由500到1000个核孔蛋白（NUPs）组成分子质量为50-100MDa的蛋白结构。近年来，遗传、生物化学和高分辨率结构技术已经成功研究了NPC的结构组成【2】，但其生物发生的关键细节尚不清楚，这或与NPC的巨大分子量、与脂膜相关以及其在基因表达的中心作用造成研究的障碍有关。
近日，来自苏黎世联邦理工学院的 Karsten Weis 和 Evgeny Onischenko 在Cell杂志上发表文章 Maturation Kinetics of a Multiprotein Complex Revealed by Metabolic Labeling，开发出高通量分析蛋白复合物的天然组装动力学的策略，并对酵母中320对核孔蛋白NUPs组成约50MDa核孔复合物的组装过程进行表征。发现一些NUPs通过迅速的交换，共组装发生较快；一些需要较长的成熟步骤。揭示出NPC生物发生过程中的层次性原则，即单个的亚复合物在1分钟的时间尺度上形成，然后需要1小时的成熟过程才能完成从中心到外围的共同组装。
蛋白质复合物的形成可以看作一个代谢过程，首先从较小的区块（氨基酸）合成新的蛋白质，然后通过一系列的成熟中间产物（包括折叠和多亚基组装步骤）进行处理，最终形成成熟复合物。基于此，研究人员开发出KARMA（kinetic analysis of incorporation rates in macromolecular assemblies）技术，首先将目标复合物的一个蛋白组分使用亲和力标记（“诱饵”），新和成的蛋白质在活跃生长的细胞中使用SILAC（细胞培养中使用氨基酸进行稳定同位素标记）进行脉冲标记。标记的蛋白在标记后的几个时间点使用亲和力pull-down进行分离，确保检测到与“诱饵”结合的复合物成分（“猎物”）。对于每个时间点，分析的复合物使用质谱分析，计算每个猎物的同位素蛋白质标记的范围。
由于结构成熟过程，猎物蛋白质中同位素标记的出现不可避免会延迟。为了使用一个定量的框架将KARMA中观察到的标记动力学与成熟过程中的组装时间联系起来，研究人员开发了一个简单的动力学状态模型（KSM），类似于用于分析代谢通量的模型。KSM描述了在细胞生长中，同位素标记的氨基酸蛋白质复合物成熟过程中的传播过程，因为他们与猎物蛋白结合在一起，并伴随着不同的成熟状态。最简单的情况就是，氨基酸从成熟状态（S1，新生成的猎物蛋白质折叠或与其他成分结合）过渡到成熟状态（S2，猎物蛋白与诱饵共同组装，产生最终的KARMA读数），即不可逆的2步装配过程。而其他因素，如猎物蛋白的动态交换、降解或氨基酸的更新，可以通过引入额外的KSM状态和通量进行解释。同时，这些也适用于那些可以可逆地分离和在复合物之间动态交换的蛋白质，这些蛋白质的标记动力学可通过向KSM中添加反向通量来表示，并且模拟稳定结合的蛋白质，即可逆的2步装配过程。利用复合物的不同结构组分作为亲和力诱饵进行KARMA分析时，在一个有序成熟过程中，当诱饵位于给定猎物的较远的下游时，预期会观察到一个更大的有效成熟库（effective maturation pool，EMP）。通过提供成熟状态下蛋白质组分的估计，EMP给出了给定猎物蛋白质相对于不同诱饵的成熟过程的长度，其中更下游的诱饵将产生更高的EMPs。这种动态读数为成熟过程中的多个诱饵-猎物的配对提供相似性的衡量，可以用来描绘结构性生物发生事件的顺序和事件。为了验证KARMA的可行性以及实用性，研究人员在活跃生长的酵母细胞中对320对NUPs的共同组装动力学以及NPC的生物发生进行研究，描绘了NPC生物发生的天然顺序和时间。NUPs首先形成亚复合物，然后有层次地组装形成从中心到外周的结构。NPC成熟过程中，单个的NUPs的处理速度具有非常大的差异，范围从几分钟到1小时；并且组装到NPCs中的机制也不相同，一些通过动态交换，一些通过费时的成熟过程转变。
总的来说，研究发现了NPC生物生成的中心原则，并证明了使用代谢标记来表征大分子复合物的动力学方法（KARMA）的强大功用，为研究多蛋白组装的细胞内动力学提供新工具。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.0011. Heusel, M., Bludau, I., Rosenberger, G., Hafen, R., Frank, M., Banaei-Esfahani, A., van Drogen, A., Collins, B.C., Gstaiger, M., and Aebersold, R. (2019). Com- plex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Mol. Syst. Biol. 15, e8438.2. Lin, D.H., and Hoelz, A. (2019). The Structure of the Nuclear Pore Complex (An Update). Annu. Rev. Biochem. 88, 725–783.
