2019年，以色列希伯来大学Yishai Avior等【1】在Cell Stem Cell 杂志发表研究，报道在1/3的人类多能干细胞系（hPSC）中存在多个癌症相关基因的点突变。通过对大量的原始态（naïve）和始发态（primed） 两种状态的hPSCs进行RNA-seq分析，发现多个tier 1癌症基因（癌症相关基因集）反复出现非同义的SNPs。而且，作者强调了这些突变出现在原始态多能干细胞中的概率比始发态高出4倍，这或与原始态需要使用几种信号通路的化学抑制剂来维持有关【2】，选择性致癌突变导致原始态在抑制剂存在的条件下具有生长优势。同时，生长和癌症相关基因的突变引发了研究人员对hPSC在体外表型和体内致瘤性的关注。近日，Cell Stem Cell杂志背靠背发表两篇文章，对上述研究结论进行勘误，Cancer-Related Mutations Are Not Enriched in Naive Human Pluripotent Stem Cells和Cancer-Related Mutations Identified in Primed Human Pluripotent Stem Cells。之前研究发现的癌症相关基因的突变仅在与小鼠滋养细胞共培养时出现，这些突变完全与小鼠的参考基因组匹配。去除小鼠来源的序列后，原始态hPSCs中癌症基因多态性的实际发生机率几乎为0。第一篇文章来自剑桥大学的Ge Guo和Austin Smith合作。由于Avior等人2019的文章中使用了其团队发表的数据集，观察到原始态细胞系cR-S6EOS中出现TP53和其他基因的突变，而他们自己团队并未观察到，所以对该数据进行了重新分析。首先使用GATK流程分析SNPs，鉴定出～14000 SNPs，但不包含Avior 2019报道的突变（简写为Avior SNPs）。去除较为苛刻的过滤步骤后，观察到相似的癌症相关突变，而且在两种不同代数的cR-S6EOS重复样本中鉴定出17个Avior SNPs。数据中的原始态hPSC有两种培养条件：1）小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs）作为滋养层；2）从MEFs转移到laminin并超过3次传代。两种培养条件下传代的次数是类似的，然而在laminin培养的cR-S6EOS中并未观察到癌症相关SNPs，且Avior SNPs仅出现在MEFs培养的cR-S6EOS中，而在laminin培养中完全检测不到。同样的结果出现在胚胎来源的原始态细胞系HNES1中。而且两者MEF培养中出现的癌症相关SNPs具有显著的重合。将Avior SNPs与MEFs基因组进行比对，发现其与小鼠基因组具有>99%的相似，而与人类基因组相似度较低。XenofilteR可鉴定并去除比对到小鼠而不是人类基因组的序列，分析发现MEFs共培养样本中，XenofilteR去除的数据序列较多，且占总序列的比例较高。去除了小鼠的序列后，Avior SNPs在所有样本中几乎降低为0。XenofilteR对检测真正的人类SNPs没有影响，在cR-S6EOS和HNES1样本中仍然检测到40000个以上的SNPs；对于laminin培养的hPSCs，使用XenofilteR对SNPs数量没有明显影响。XenofilteR去除的序列与小鼠参考基因组匹配，与人类参考基因组具有4个以上的错配。XenofilteR流程后依然存在3个SNPs，分别是TP53（pR181H、pR248Q）和CDK12（pE131K）。
第二篇文章来自希伯来大学的Nissim Benvenisty，Yishai Avior为一作。研究人员使用修改后的分析流程对来源于人类胚胎干细胞系（hESC）WA01和WA09的172个公开的RNA-seq数据进行分析，这两株细胞系已经存在并使用了20年，是hESC研究中使用最为广泛的细胞系。在56/172个样本中鉴定出4个不同基因的8个癌症相关点突变，其中TP53是最常见的突变基因，具有4个单独的突变，依次还有EGFR、PATZ1和CDK12。而TP53和CDK12的突变同样在Ge Guo等的分析中被发现。67%的分析样品中并不携带COSMIC癌症数据集的突变，然而33%的始发态hESC样本至少有一个获得性突变（该突变存在于COSMIC），6%具有两个不同的突变。经过分析，93%的具有癌症相关突变的样本没有表现出较大的染色体畸变（52/56），仅有4个样本表现出非整倍体，表明染色体畸变不是获得癌症相关突变的主要驱动力。总的来说，两篇文章同时确认了原始态干细胞的RNA-seq检测出癌症相关突变的原因是小鼠基因序列的污染，而实际上癌症突变的机率很低。为人们解除了使用多能干细胞中，对于体外传代过程中获得病理性突变的担心，进一步阐释了多能干细胞的安全性。https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.11.014https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.11.0131. Avior, Y., Eggan, K., and Benvenisty, N. (2019). Retraction. Cell Stem Cell 28, this issue2. Dong, C., Fischer, L.A., and Theunissen, T.W. (2019). Recent insights into the naı ̈ve state of human pluripotency and its applications. Exp. Cell Res. 385, 111645.
