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Nature | 于洪军/刘晓天/张敏揭示真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成的分子基础和棘白菌素类抗真菌药物的耐药产生机制

侵袭性真菌感染每年造成超过150万人死亡,临床多发于免疫缺陷、器官移植、重症新冠肺炎等高危人群,患者病死率极高【1】。这一严重疾病的治疗却面临药物种类极为有限、药物毒副作用大、耐药菌株不断出现等严峻问题【2】,因此,迫切需要开发多种新型抗真菌药物以应对当前需求。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁特有的核心多糖成分,其合成途径是开发抗真菌药物的关键靶点,成功的靶向药物包括临床上广泛使用的棘白菌素类一线药物以及近期引起广泛关注的新药艾瑞芬净(ibrexafungerp)和瑞扎芬净(rezafungin)【3,4】。然而,长期以来,对真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成机制缺乏了解,是领域内面临的瓶颈问题。虽然一些间接证据提示了FKS1是可能的葡聚糖合成酶,但至今仍缺乏二者联系的直接证据。另外,棘白菌素类药物的抗真菌机制是什么?广泛出现的耐药性来源是什么?这一系列与临床紧密联系的关键问题仍不清楚,严重阻碍了该领域新药创制的发展。


2023年3月22日,华中科技大学同济基础医学院、细胞架构研究中心于洪军教授、张敏副研究员,与南方科技大学生命科学院张明杰院士、刘晓天副研究员组成的联合研究团队在Nature期刊发表了题为“Structural and mechanistic insights into fungal β-1,3-glucan synthase FKS1”的研究论文,解开了困扰领域多年的抗真菌药物重要靶点-真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成及其靶向药物的耐药产生机制之谜,对于应对侵袭性真菌感染这一临床问题具有重要科学意义。

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FKS1属于大分子量的膜蛋白,且活性对环境非常敏感,其功能和机制的解析一直是世界性难题。研究团队利用在糖生物学和膜蛋白领域积累的研究经验,巧妙的设计并筛选到了影响FKS1活性的重要突变:一定条件下高活力的S643P突变和丧失活力的K1261A突变,并通过长期摸索获得了关键的提纯和反应条件。在此基础上,对体外聚合产物应用糖苷酶水解、薄层层析、糖苷键甲基化色谱质谱分析等手段进行多角度分析,首次直接证明了FKS1可以特异性合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖,解决了领域内的关键问题(图1a-d)。研究人员据此建立了FKS1活性的非放射性检测体系,相比于传统上繁琐的放射性标记检测,更有助于建立简易、高效的药物筛选体系,具有非常重要的应用价值。

0 (1).png图1. FKS1特异性合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的功能和机制研究。(a) FKS1的功能及其靶向药物的作用模式图; (b-d) FKS1的活性及其体外聚合产物表征分析; (e) β-1,3-葡聚糖合成机制的系统性突变研究; (f-h) FKS1对棘白菌素药物的敏感性实验和耐药性来源分析。
为了从分子水平更深入的认识真菌β-1,3-葡聚糖的合成机制,研究人员应用冷冻电镜技术首次报道了FKS1的高分辨率结构(3.4 Å),并鉴定出了两个关键功能区域:在胞质一侧,GT结构域与跨膜结构域围绕形成一个近细胞膜的催化反应中心;在跨膜结构域中,跨膜螺旋TM5-8、TM11-12以及界面螺旋IF1围绕形成了一个半闭合的聚糖跨膜转运通道。通过系统性突变研究以及体内、体外功能分析,研究人员进一步提出并确定了FKS1合成β-1,3-葡聚糖的催化和转运机制,在多种致病真菌中高度保守,对于广谱抗真菌药物的开发具有非常重要的意义(图1e)

在探索靶向药物作用机制的过程中,研究人员意外的发现caspofungin(一种代表性棘白菌素类药物)对FKS1的作用因纯化条件而异,甚至表现出截然相反的效应,这打破了对此类药物作用机制的传统认知,反映了FKS1功能对膜环境的敏感性。对应的,结构分析揭示了耐药相关热点区域的空间分布和特点:位于紧邻的三股跨膜螺旋TM5-6和TM8上,并结合有多个高度有序的脂分子,形成潜在的药物结合位点(图1f-g)。药物活性测试证实了这些位点的代表性突变会显著降低FKS1对药物的敏感性,进而产生耐药性。研究人员最终解析了临床上最常见的代表性耐药突变体FKS1-S643P的电镜结构(3.5 Å),结构比对分析发现了该突变引发了耐药热点区域的显著构象变化,并导致了附近脂分子的重排(图1h)。这些结果揭示了耐药性产生的一种独特分子机理,为解决临床耐药问题提供了重要启示。

综上所述,该研究工作突破性的解决了抗真菌药物开发领域的关键问题-真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成的分子机制,揭示了棘白菌素类一线抗真菌药物的耐药产生机理。研究成果不仅有助于应对日益严峻的真菌耐药问题,也会有力推进新型抗真菌药物的开发进程,对于解决侵袭性真菌感染这一重大临床问题至关重要。

华中科技大学于洪军教授、张敏副研究员,南方科技大学刘晓天副研究员为论文共同通讯作者。华中科技大学博士研究生胡鑫霖、杨坪为共同第一作者。此次在Nature期刊发表的论文是该团队在继“抗真菌药物尼克霉素Z抑制真菌细胞壁几丁质合成的分子机制研究”(2022年发表于Cell Discovery 【5】之后,基于在糖生物学领域积累的研究基础,聚焦抗真菌药物靶点领域的又一项进展。


原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5


1 Brown, G. D. et al. Hidden killers: human fungal infections. Science translational medicine 4, 165rv113 (2012).

2 Fisher, M. C., Hawkins, N. J., Sanglard, D. & Gurr, S. J. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science 360, 739-742 (2018).

3 Perfect, J. R. The antifungal pipeline: a reality check. Nature reviews. Drug discovery 16, 603-616 (2017).

4 Hoenigl, M. et al. The Antifungal Pipeline: Fosmanogepix, Ibrexafungerp, Olorofim, Opelconazole, and Rezafungin. Drugs 81, 1703-1729 (2021).

5 Wu, Y. et al. Structures and mechanism of chitin synthase and its inhibition by antifungal drug Nikkomycin Z. Cell Discov 8, 129 (2022).

6 Formanek, P. E. & Dilling, D. F. Advances in the Diagnosis and Management of Invasive Fungal Disease. Chest 156, 834-842 (2019).

7 Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N. & Cowen, L. E. Antifungal Drug Resistance: Molecular Mechanisms in Candida albicans and Beyond. Chemical reviews 121, 3390-3411 (2021).

8 Tissot, F. et al. ECIL-6 guidelines for the treatment of invasive candidiasis, aspergillosis and mucormycosis in leukemia and hematopoietic stem cell transplant patients. Haematologica 102, 433-444 (2017).

9 Pristov, K. E. & Ghannoum, M. A. Resistance of Candida to azoles and echinocandins worldwide. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 25, 792-798 (2019).


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