“四十岁后，不滞于物，草木竹石均可为剑”。今天给大家带来一篇刚发表在NC上不久的生信文章，学习一下别人怎样利用常见的免疫，做出不一样的花样来。所谓无招胜有招，这说明，好文章不是靠随意堆砌出来的。

    免疫检查点疗法（ICT）在一些肿瘤患者中能产生显著的反应并提高生存率，然而大部分癌症对此没有反应。导致对免疫检查点（ICB）产生耐药的一个关键因素是肿瘤中原有T细胞浸润的排斥或缺失/缺乏，即所谓的“非T细胞炎症”或“冷”肿瘤的特征。由于癌症患者ICT的应答率通常较低，因此在ICT之前确定无应答者十分重要：（1）为治疗和生存时间窗口有限的患者选择有效治疗；（2）避免患者产生不必要的毒性；（3）降低治疗相关费用。目前，预测ICT反应的生物标志物包括高微卫星不稳定性（MSI-H，仅发生在约4%的人类癌症中）、肿瘤细胞PD-L1表达和肿瘤突变负荷（TMB）。然而，在一些大规模ICT试验中，PD-L1表达和TMB的组合在识别患者（如非小细胞肺癌、NSCLC）方面的表现并不理想，因此需要更强有力的方法来识别新的生物标志物。染色体区域9p21.3纯合子缺失(9p21loss）是人类肿瘤中最常见的体细胞拷贝数改变（SCANs）之一。本文证明了9p21缺失与“冷”肿瘤免疫表型和ICT原发性耐药的普遍相关性，并提出了一种泛癌生物标记物来预测对ICT缺乏反应的患者。

    tips：“冷”肿瘤免疫表型可归因于多种因素，包括肿瘤抗原表达缺失、抗原提呈细胞（APC）募集缺陷、抗原提呈缺失、T细胞启动/激活缺失或失败以及T细胞转运受损（即未能渗透肿瘤床）。细胞机制，如激活的癌相关成纤维细胞（CAF）和其他抑制性免疫细胞，使肿瘤微环境对CD8T细胞的渗透性降低。此外，β-catenin、TGF-β和PI3K-AKT-mtor致癌通路的激活可促进T细胞排斥。黑色素瘤患者对CTLA-4和PD-1阻断的不良反应也与较高的拷贝数缺失负荷有关。

9p21缺失经常出现在癌症中并且与较短的生存期有关

    在染色体区域9p21的基因中。CDKN2A最常缺失（13.5%），其次是MTAP（9.3%）。CDKN2A和MTAP在9p21上相隔约100kb，在人类癌症中通常共缺失。除了纯合缺失 (HD) 外，分别在 24.6% 和 27.8% 的癌症中观察到由于 CDKN2A 和 MTAP 半合缺失导致的杂合性缺失 (9p21 LOH)。虽然在 9p21-LOH 肿瘤中 CDKN2A/MTAP 的 mRNA 表达中仅观察到细微的变化（与野生型相比），但肿瘤细胞中基因的同源缺失导致其在肿瘤组织中的表达水平显着降低。

    选择 12 种具有频繁（>10%）9p21缺失的癌症类型进行后续分析。在这 12 个癌症队列中的 7 个，9p21缺失的频率在先前定义的分子亚型中差异很大在多个TCGA 癌症队列中，具有 CDKN2A/MTAP 纯合共缺失的患者和具有任一基因 HD 的患者的生存期显着缩短。I型干扰素基因簇的基因组位点位于9p21上MTAP上游约320kb处，在一部分癌症中常与CDKN2A/MTAP共缺失。根据CDKN2A/MTAP和I型干扰素基因的CNV状态分层的生存分析显示，各组的OS无统计学差异。尽管9p21的LOH并没有导致CDKN2A/MTAP表达的巨大变化，但与9p21WT肿瘤相比，它使OS显著缩短。生存时间的差异在调整先前定义的分子亚型以及潜在的混杂因素之后仍然显著。

9p21 缺失与 TCGA 癌症中的“冷”肿瘤免疫表型相关

    肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的空间结构是肿瘤的一个重要病理特征，具有预后价值。最近一项基于标准病理学癌症图像分析的TIL模式泛癌研究显示，TCGA癌症中存在高度的空间异质性。总体而言，与 9p21-WT肿瘤相比，我们观察到9p21缺失肿瘤中TIL的密度降低（TIL斑块较少），支持9p21缺失和癌症空间免疫景观之间的相互作用。

    接下来用MCPcounter、CIBERSORT方法评估免疫细胞浸润情况。在大多数（10/12）经常发生9p21缺失的癌症类型中（与9p21WT肿瘤相比），B细胞、T细胞、NK细胞、T滤泡辅助细胞、记忆CD4T细胞、CD8T细胞和细胞毒性淋巴细胞的丰度显著降低，并且这些变化在基于先前定义的分子亚型的分层分析中仍然显着。另外，在多个 TCGA 队列中，9p21缺失的肿瘤中T细胞受体(TCR)的丰度和多样性降低。作者还进行了GSEA富集分析，PDL1的表达分析，发现与免疫相关的通路被抑制，而抑制免疫相关通路下调。总之，这些调节免疫细胞募集、T细胞活化和克隆扩增的免疫调节因子的下调以及免疫抑制信号的上调可共同导致9p21缺失肿瘤中的“冷”免疫表型。

9p21 缺失与抗 PD-1/PD-L1单药治疗的原发性耐药有关

    鉴于有证据表明“冷”肿瘤不太可能对免疫治疗产生反应，因此假设治疗前具有 9p21缺失的患者可能表现出对ICT的低临床反应率。为了确定 9p21 缺失对接受 ICT 治疗的患者临床结果的影响，本研究对来自 8 个实体瘤队列（>1000 名患者）接受 ICT（单一疗法）的患者的免疫基因组学和临床数据进行了综合分析。

    首先，筛选了 IPCT的临床试验数据库，并确定了 561 名治疗前癌症有 9p21 缺失的患者，在这些患者中，71 名接受抗 PD-1/PD-L1 单药治疗，48 名有反应数据。6 名患者因罕见癌症类型被排除，最终筛选出一组42 名具有9p21缺失的患者，另外匹配了52名临床形状大抵相近的9p21野生型患者进行分析。可以看得出来，无论是”反应性“肿瘤还是”难治性“肿瘤，9p21缺失的病人的缓解率（完全缓解/部分缓解）较低，而进展率较高。

    然后在四个已发表的黑色素瘤队列中评估了9p21缺失对ICT 临床反应的影响（根据 CDKN2A 和 MTAP 的表达水平推断 9p21 状态，想一想为什么这么做，参考图1c），对于所有四个队列，患者接受 ICT 作为单一疗法（没有 ICT 既往史），并且可以观察到 hi_hi 和 lo_lo 组之间对 Nivolumab 单药治疗的反应率存在显着差异， hi_hi 组对RECIST 反应更好。把四个队列合一分析，差异仍然显著。

    接下来，在一个大型独立系列中评估这些发现在其他癌症类型中的有效性。首先评估来自 MD Anderson 癌症中心的转移性尿路上皮癌 (mUC) 队列，该队列由 86 名接受 pembrolizumab (n = 64) 或 atezolizumab (n = 22) 单药治疗的患者组成。MTAP 蛋白水平阳性状态是通过 CLIA 认证的 IHC 测试确定的。MTAP 的蛋白质水平阳性被用作 9p21 丢失的替代生物标志物（类似于上面的hi_hi和lo_lo，知道为什么这么做吗），并将患者分为 MTAP 阳性（MTAP+，n = 58）和 MTAP 阴性（MTAP-，n = 22）组。在一部分患者中进行了肿瘤细胞中的 PD-L1 IHC染色，显示出MTAP- 组肿瘤中 PD-L1 阳性比例降低的趋势。总体而言，MTAP-组中有 9%的患者在 pembrolizumab 或 atezolizumab 单药治疗后达到 CR/PR，这比 MTAP+ 组中观察到的低三倍以上。相反，与MTAP+ 组相比，MTAP− 组发生疾病进展的患者比例显着增加。此外，与MTAP+ 组相比，MTAP-组患者的无进展生存期 (PFS) 和疾病特异性生存期 (DSS) 的生存期均显着降低。

    另外一组非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者进一步证实了 9p21 缺失与对 ICB 缺乏反应有关。与 9p21-WT 组相比，9p21-缺失组患者的持久临床获益率（DCB）降低了 4 倍以上。在先前研究中显示，TMB 低（低于组中位数）的患者 DCB 率为 20%，而 TMB17 高的患者为 36%，而 9p21 缺失的存在与较低的 DCB 发生率相关，与 TMB 水平无关。同样，PD-L1 阴性患者的 DCB 发生率为 18%，而 PD-L1 阳性（≥1% 表达）的发生率为 36%，而对于 9p21 缺失的肿瘤，无论 PD-L1 表达水平如何，都没有患者具有 DCB。鉴于在先前研究中有 10% 的低 TMB 和 PD-L1 阴性的患者达到 DCB，这表明 9p21 丢失可能作为一种生物标志物，可以补偿其他生物标志物，包括 PD- L1 表达和 TMB 水平，特别是在识别不太可能从 PD-1/PD-L1 单药治疗中受益的 NSCLC 患者时。与此一致，我们发现无论 TMB 水平或 PD-L1 表达如何，治疗前肿瘤有 9p21 缺失的患者都具有更短的 PFS，表明 9p21 缺失作为预测用 PD-1/PD-L1 单药治疗结果不好的生物标志物的潜在价值。

    最后，这些发现在另一项大规模 2 期试验 (IMvigor210) 中得到了复制，该试验调查了转移性尿路上皮癌 (mUC) 患者的 PD-L1 阻断剂 (atezolizumab) 治疗。仍然根据 CDKN2A 和 MTAP 的表达水平推断9p21的状态，如前面的黑色素瘤。将 CDKN2A/MTAP 表达分层为递增的的四分位数，MCPcounter推断的 CD8 T 细胞、NK 细胞、细胞毒性淋巴细胞的丰度以及由 CIBERSORT 估计的 M1 样巨噬细胞的相对比例在低 (Q1 ）比高（Q4）CDKN2A 表达的肿瘤中显著降低。lo_lo 组的肿瘤中 PD-L1 mRNA 表达下调（补充图 21b）。免疫细胞和肿瘤细胞上的 PD-L1 蛋白表达水平在 lo_lo 组中降低，尤其是在 CDKN2A 表达低 (Q1) 的肿瘤中。此外，“炎症型”免疫表型的比例在低水平组（Q1）中显着低于高水平组（Q4）。接下来探究了 CDKN2A/MTAP 表达的降低如何影响抗 PD-L1（atezolizumab）治疗的反应率。当 MTAP/CDKN2A 表达水平被分层为递减的四分位数时，CR/PR 率随着 MTAP/CDKN2A 表达水平的降低而显着下降，CDKN2A 加 MTAP 表达的复合物表现出更大的差异。多变量 Cox 回归分析表明，9p21 缺失是短期生存的有力预测指标，与免疫细胞 PD-L1 表达或 TMB 水平等其他变量无关。

    接着进一步评估了 9p21 缺失是否可以与 PD-L1 表达或 TMB 协同识别对 atezolizumab 无反应的病（图 5e）。免疫细胞上PD-L1高表达和治疗前肿瘤中CDKN2A/MTAP高表达的患者反应率最高（36%），PD-L1低表达但在其治疗前肿瘤中 CDKN2A/MTAP 高表达的患者也反应良好，而免疫细胞上 PD-L1 低表达和 CDKN2A/MTAP 低表达的患者反应率最低。同样，治疗前肿瘤中 TMB 低和 CDKN2A/MTAP 表达低的患者的 CR/PR 率仅为 3.5%，比最佳组（高 TMB 和CDKN2A/MTAP 高表达）低12.9倍，比仅基于 TMB 水平分层的低 TMB 患者的比率低 3.4 倍。

    为了评估研究结果的转化性，使用这三个因素（9p21、免疫细胞上的 PD-L1 表达、TMB）建立了一个逻辑回归模型，并在mUC 队列中进行了测试，都显示出轻微的显著性（分别为 P = 0.05、0.06、0.05）。然后，我们建立了一个包含这些因素的“反应评分”，并将患者分为 3 组，分别为高 、中 、和低反应评分。本文数据表明，只有 2.4% 的患者反应评分 = 0 且有反应，而有14%反应评分为 1-2 的患者 和 46%反应评分为 3-4 的患者达到CR/PR。该模型使我们能够将患者分为由几乎完全无应答的患者组成的底部组（反应评分 = 0），中间组（反应评分 = 1-2) 表现出的反应率比底部组患者高约 6 倍，而顶部组 (反应评分 = 3-4) 高20倍，即为从ICT 获得最大治疗获益的患者。生存分析显示，在治疗前肿瘤中 CDKN2A/MTAP 表达低的患者预后较差，这表明我们提出的 9p21 状态加 PD-L1 或 TMB 的组合可以更好地对患者进行分层。

9p21缺失肿瘤的治疗缺陷和潜在靶点

    为了开发替代策略来克服 9p21 缺失肿瘤患者的 ICT 耐药性和不良临床结果，我们通过挖掘可用的生物数据集探索了潜在的药物靶点。首先对精选的约 500 个基因进行差异基因表达 (DEG) 分析（包括已知和新兴的可行免疫调节靶点和其他可药物治疗的癌症靶点），确定了 26 个显着上调的基因。其中，一些是癌症免疫治疗中很有前景的治疗靶点，如TGF-β信号通路(TGFB1，SMAD3)、Siglec-15(SIGLEC15)、CEACAM1、VEGFA48，以及其他可药用靶点如PRMT1、丙酮酸激酶 M2 (PKM) 和葡萄糖转运蛋白1(SLC2A1/GLUT1)。一致地，我们观察到 MTAP/CDKN2A 的 mRNA 表达与许多这些上调基因之间存在强烈的负相关性，有趣的是，这些基因在atezolizumab治疗后进展的lo_lo组肿瘤中显著上调。

    最后，为了检查这些潜在靶标是否广泛适用于其他具有 9p21 缺失的肿瘤类型，对这 500 个基因进行了泛癌分析，重点关注 12 种频繁 9p21 缺失的癌症类型。我们发现一些药物靶点如 TGF-β 信号通路、CDK6、PRMT1、Siglect-15、CD73 (NT5E)、葡萄糖转运蛋白1、TIGIT 通路 CD155/CD11、PKM、TWEAK受体 Fn14和 VTCN1 (B7-H4) 存在于多种癌症类型中，证明与 CDKN2A/MTAP 表达呈显著负相关，还有其他一些是肿瘤类型特异性的，例如 CEACAM1、IDO1 和 SIRPa。这些结果表明，由于这些可药用靶点在不同肿瘤类型/亚型中的差异表达，应将具有 9p21 缺失的肿瘤视为异质组并需要量身定制治疗。

    总之，本文研究表明，9p21 缺失是泛癌基因组冷免疫表型决定因素，并有助于对 ICT 的原发性耐药。9p21 缺失可作为对 ICT 反应较差的潜在生物标志物，并指导患者分层治疗和开发替代治疗干预措施。