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“铜死亡”顶级研究文献解读

对细胞来说,铜是一把双刃剑。铜是所有生物体必不可少的辅助因子,主动稳态机制通过跨浓度梯度发挥作用,将细胞内铜浓度保持在非常低的水平,以防止细胞内游离铜累积,对细胞有害。然而,即使是适度的细胞内铜浓度也可能有毒,导致细胞死亡。铜稳态的遗传变异导致致命的疾病,并且铜离子载体和铜螯合剂都被认为是抗癌剂。然而,过量的铜如何诱导细胞死亡尚不清楚。

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图源[1]

2022年3月17日,来自美国哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所的TODD R. GOLUB团队在Science期刊上发表了题为Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins的研究性论文,证明铜毒性的发生机制不同于所有其他已知的调节细胞死亡机制,包括细胞凋亡、铁死亡、焦亡和坏死性凋亡,并将这种以前未表征的细胞死亡机制称为铜死亡

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图源[2]



研究思路

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研究内容

铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累

铜离子载体是与铜结合的小分子,可将铜穿梭到细胞中,因此是研究铜毒性的有用工具。多项证据表明铜离子载体诱导细胞死亡的机制涉及细胞内铜的积累,而不是小分子伴侣本身的影响。首先,研究者发现结合铜的多个结构不同的小分子在数百个细胞系中共享杀伤谱。其次,结构功能关系实验表明,消除这些化合物的铜结合能力的修饰导致细胞杀伤力丧失,而铜螯合消除了化合物的细胞毒性。这些结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。

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铜离子载体诱导一种独特形式的细胞死亡

研究者提出科学问题,铜离子载体介导的细胞死亡是否受到调节,特别是短期暴露是否会导致不可逆转的后续细胞毒性。为了解决此问题,用浓度低至40 nM铜离子载体elesclomol脉冲处理仅2小时,使细胞内铜水平增加15-60倍。24小时后,发现引发细胞死亡。该结果表明铜介导的细胞死亡确实受到调节。

细胞死亡包括一系列信号级联和分子机制。例如,细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡和铁死亡的特征中涉及蛋白质和脂质。此前报道表明elesclomol诱导ROS依赖性细胞凋亡,但elesclomol诱导的细胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激(细胞凋亡的标志)。而且,当细胞凋亡的关键效应子BAX和BAK1被敲除,或用泛半胱天冬酶抑制剂(Z-VAD-FMK和Boc-D -FMK)处理细胞,elesclomol的杀伤潜力仍被维持,再次表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同。此外,用其他已知细胞死亡机制的抑制剂治疗,包括铁死亡(ferrostatin-1)、坏死性凋亡(necrostatin-1)和氧化应激(N-acetyl cysteine),都未能消除铜离子载体诱导的细胞死亡。以上结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡机制与已知细胞死亡途径不同。

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线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡

接下来,研究者探索了介导铜离子载体诱导的细胞死亡途径的机制。发现更依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感性是糖酵解细胞的近1000倍。因此,与对铁死亡诱导的GPX4抑制剂ML162的敏感性相比,用线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂处理,对铜离子载体的敏感性具有更显著的影响。此外,电子传递链复合物I和II的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取抑制剂可减轻细胞死亡,但对铁死亡没有影响。重要的是,线粒体解偶联剂FCCP对铜毒性没有影响,这表明线粒体呼吸,而不是ATP的产生,是铜诱导的细胞死亡所必需的。然而,用铜离子载体处理不会显著降低基础呼吸或ATP相关呼吸,但会显著降低呼吸的储备能力,提示铜不直接靶向ETC,而是靶向TCA循环的组成部分。

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FDX1和蛋白质脂酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子

为了确定介导铜毒性的特定代谢途径,研究者进行了全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选,以确定参与铜离子载体诱导死亡的基因。为了最大限度地提高筛选的普遍性,专注于两种结构不同的载铜离子载体(elesclomol和disulfiram的活性形式diethyldithiocarbamate)的交叉点。通过敲除7个基因挽救了这两种化合物的杀伤作用,其中包括FDX1(编码一种还原酶,已知可将Cu2+还原为更具毒性的形式Cu1+,并且是elesclomol的直接靶标),和编码硫辛酸途径(LIPT1,LIAS,DLD)和脂酰化蛋白质靶点的六个基因的任一组分。进一步,通过个别基因敲除研究,证实了FDX1和LIAS的缺失,使得细胞具有了对铜诱导的细胞死亡的抵抗力,提示FDX1和蛋白质脂酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子。

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FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子

蛋白质脂酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰,已知仅发生在四种酶上,所有这些酶都涉及调节碳进入TCA循环的代谢复合物。本研究发现敲除FDX1或脂酰化相关酶可以拯救细胞免受铜毒性,那么FDX1是否可能是蛋白质脂酰化的上游调节子。为了检验这个假设,进行了三项分析。首先,我们在数百个癌细胞系中全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选资源库Cancer Dependency Map (www.depmap.org) 中,发现相似模式的生存能力影响的基因,即使是微妙的,表明它们具有共同的功能或调节。值得注意的是,在整个细胞系组中,FDX1和硫辛酸途径成分的活力效应高度相关。其次,研究者对208个人类肿瘤标本中的FDX1和硫辛酸进行了免疫组织化学染色,半定量光镜评分显示FDX1和脂酰化蛋白的表达高度相关。最后,FDX1敲除,使用硫辛酸特异性抗体检测DLAT和DLST脂酰化。结果显示FDX1敲除导致蛋白质脂酰化完全丧失。此外,敲除LIAS还导致细胞呼吸显著下降。以上数据表明FDX1 是蛋白质脂酰化的上游调节因子。

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铜直接结合并诱导脂酰化DLAT的寡聚化

上述实验建立了铜毒性和蛋白质脂酰化之间的联系,但没有建立直接的机制联系。研究者假设铜可能直接与脂酰化蛋白质结合,观察到铜与游离硫辛酸结合的可能性为10-17。为了验证这一假设,研究者从细胞裂解物中纯化了DLAT和DLST,发现这些蛋白质与带铜的树脂结合,但不与钴或镍树脂结合。当 FDX1 缺失消除蛋白质脂酰化时,DLAT和 DLST 不再结合铜,表明蛋白质的硫辛酰部分是铜结合所必需的。

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铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同

至此,以上描述的实验使用铜离子载体来克服细胞内铜浓度保持在低水平的稳态机制。这些机制包括铜输入者SLC31A1 (CTR1) 和铜输出者ATP7A和ATP7B,它们分别由在铜失调综合征门克病和威尔逊病中发生突变的基因编码。为了探索与铜离子载体治疗相关的铜毒性机制是否与这些自然发生的铜稳态紊乱相同,研究者检查了三个实验模型。首先,在人胚胎肾 (HEK) 293T 和ABC1细胞中过表达 SLC31A1,这显著增加了对生理铜浓度的敏感性。重要的是,在过表达 SLC31A1 的细胞中,铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能阻止铜诱导的细胞死亡,而铜螯合剂、FDX1 KO 和 LIAS KO 均能部分挽救铜诱导的细胞死亡。此外,天然细胞内铜伴侣谷胱甘肽的消耗导致铜依赖性细胞死亡。最后,研究者使用了威尔逊氏病的小鼠模型,其中Atp7b缺失导致细胞内铜积累和细胞随着动物年龄的增加而死亡。将老年Atp7b缺陷 (Atp7b-/-)小鼠的肝脏与Atp7b杂合子 (Atp7b-/+) 和野生型对照小鼠的肝脏进行比较,观察到脂酰化和Fe-S簇蛋白的丢失,以及Hsp70(是分子伴侣和折叠催化剂的细胞网络的核心组成部分)丰度增加。这些在铜毒性小鼠模型中的发现,表明铜过载导致的细胞效应与铜离子载体诱导的细胞效应相同。总之,这些数据表明过量的铜促进脂酰化蛋白质的聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定,导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。

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总结

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本研究揭示了一种新的细胞死亡机制——铜死亡,证明铜诱导的细胞死亡是由一种古老的机制介导的:蛋白质脂酰化。表明铜死亡是通过铜与TCA循环的脂酰化成分直接结合而发生的,这导致脂酰化蛋白质聚集,以及铁硫簇蛋白质丢失,从而导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子,FDX1和蛋白质脂酰化是铜死亡的关键调节因子。这些发现可以解释细胞对古老的铜稳态机制的需求。


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本次检索得到的 1000 篇文章,共发表在 346 份杂志上,其信息总结如下表: (按照文章数降序排列)

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参考文献

[1] Oliveri, V. (2020). Biomedical applications of copper ionophores. Coordination Chemistry Reviews, 422, 213474.

[2] Tsvetkov, Peter, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science 375.6586 (2022): 1254-1261.


文章来源:科研讲坛 ,作者大师姐

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