肺癌的靶向治疗如火如荼地进行，然而耐药问题依旧是个unsolved problem。今天我们一起来学习一篇发表在Nature子刊上的研究耐药机制的文章。文章名为：Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer，它用单细胞RNA测序的“花式分析”来证明细胞系、异种移植肿瘤和患者肿瘤中有多个癌细胞亚群，这些亚群表现出表观遗传变化和不同的治疗敏感性。

该文章来自于位于美国芝加哥的University of Illinois at Chicago的Alexandre F. Aissa博士实验室，该团队致力于研究靶向治疗耐药问题，靶向治疗最成功的例子之一是酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在EGFR突变患者的使用，尽管大多数患者对EGFR-TKIs，比如厄洛替尼，吉非替尼的治疗均表现出良好的疗效，但经过一段时间的治疗后，患者往往出现耐药现象，此外，这些药物在某些患者身上一开始就展现不佳的疗效。这些潜在的耐药机制仍有待阐明。

1.在厄洛替尼处理的 PC9 细胞中发现耐药状态，细胞居然发生了分群。

为探究TKI的耐药机制，作者用不同时间和剂量的厄洛替尼和奥西替尼的剂量反应（图AB），发现部分细胞在初始状态对药物有一定抗性（ DTP初始耐药），还有部分细胞经过厄洛替尼处理后产生耐药性（DTEP激发耐药）。随后作者搜集了不同处理天数的不同耐药细胞进行单细胞RNA-seq测序（图D）。通过UMAP降维，对测序结果进行可视化，展现的是类似的基因表达特征和主成分，初始未知量细胞主要分成三部分（编号123），厄洛替尼治疗后的细胞增加到五部分（编号45678），提示细胞的基因表达亚型发生变化。

同时，作者用Velocyte software确定这些单细胞群cluster的细胞周期状态。结果提示DTP进入了相对静止的状态，而DTEP还处在活跃状态（图E）。随后作者对测序结果进行验证，一方面参照已发表文献的耐药基因进行比对(图F)，另一方面利用D11和D0细胞的Drop-seq、bulk RNA-seq 和 ChIP-seq结果及部分基因的功能验证，确定筛选出的大部分差异基因在多个数据库中均有相同趋势，而且具有功能，进一步阐明了单细胞测序数据的准确性（图G,H）。

2.用药方式改变对耐药性是否有影响？

然后，作者想看看，如果用药之后，停药，再用药，又会有什么样子的结果，下图中图A就展示了这种不同用药方式以及相关的基因表达。单细胞亚群的聚类分析提示，停药后重新用药的细胞与只用药两天的细胞有许多类似特点，如 MAPK级联激活，抗性基因CALD1、CCDC80、TPM1、TACSTD2 恢复表达等。意味着这种药物诱导的耐药其实是可逆的。

3.这种耐药机制的亚型转变是否还会出现在其他肺癌细胞系中？

接下来作者又用了其他细胞系模型来试试，下图展示了四种细胞模型UMAP聚类降维图以及基因富集分析。发现这些基因大多与细胞凋亡调控、MAPK等通路相关。而且在不同细胞系中，均观察到抗凋亡基因、NF-κB和MAPK途径在早期耐药细胞中激活，提示在不同肺癌细胞系中早期耐药基因表达有一定的共性。

4.是否能区分不同耐药亚群细胞，逐个击破呢？

作者将治疗前后的两个PC9细胞样本进行单细胞测序和UMAP降维分析，用Velocyto和PAGA 图，来识别新兴的药物耐受亚群。然后箭头反映了附近细胞亚群的“移动”方向。提示通过跨细胞簇的富集过程和基因分析可以区分细胞亚群。

5.选用靶向耐药基因的抑制剂“逐个击破”

在耐药细胞株中许多相关基因过表达，作者认为下调这些基因有利于恢复敏感性。作者利用基于集成网络的细胞特征库 (LINCS) 进行分析，该库对 15 种癌细胞系中的 268 种小分子抑制剂的基因表达反应进行了分类。发现克唑替尼和 celastrol 是在不同细胞亚群中的有效抑制剂。

但是癌细胞也很“狡猾”，可以对不同的药产生不同的抗性，甚至会出现双重耐药性。作者发现原本厄洛替尼耐药的细胞，使用克唑替尼治疗后没有出现新的亚群，通过一系列Drop-seq，smRNA-FISH，功能验证进行检测分析，作者得出结论，联合治疗可能通过下调特定的存活机制来减少细胞群的异质性。

6.动物实验和患者标本中均发现类似规律

动物的体内实验发现用小鼠模型发现克唑替尼会对奥西替尼耐药的细胞群有抑制作用。

最后作者在人群水平，利用scRNA-seq 识别患者肿瘤中的癌细胞群和潜在的药物敏感性，作者还在GSEA排名中获得了许多非常重要的药物，包括各种 CDK 抑制剂和 AKT 抑制剂 A443654，将文章中的规律推广到临床。

单细胞分析是全文的分析手段，但明显和其它单细胞分析文献的单一模式截然不同，花花绿绿的图是不是让你一开始没看懂呢，Calm down！文章用花式的单细胞RNA测序让我们了解细胞系、异种移植肿瘤和患者肿瘤中有多个癌细胞亚群，这些亚群表现出不同表观遗传和不同的治疗敏感性。同时用LINCS数据库分析预测和功能验证针对选定耐药细胞群体的小分子。

此文献揭示了与EGFR抑制剂联合使用，克唑替尼这个TKI药物可抑制双重耐药株的出现，研究亮点在于从多个层面展示药物耐受，以及联合用药抑制特定耐受细胞亚群的一系列相关的变化，文中分析证明单细胞 RNA 数据可用于：（1）区分药物耐受状态；(2) 发现独特的细胞亚群，可能反映耐药细胞的功能异质性；(3) 选择有效的药物和药物组合来靶向持久细胞亚群。相信对于单细胞的耐药研究有许多启发。

来源：i生信