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8分+细胞焦亡结合免疫浸润文章解读

今天给大家介绍一篇2021年10月发表在OncoImmunology(IF:8.110)上的文章。作者对大肠癌中的细胞焦亡基因进行分析并构建预后模型,全面比较不同亚型和不同风险亚组的肿瘤微环境特征,基因突变特征和化疗敏感性差异等。


Identification of pyroptosis-related subtypes, the development of a prognosis model, and characterization of tumor microenvironment infiltration in colorectal cancer

鉴定大肠癌中细胞焦亡相关亚型并构建预后模型和肿瘤微环境浸润特征


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摘要

细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡,与肿瘤进展,预后和治疗反应有关。然而,细胞焦亡相关基因(PRGs)在肿瘤微环境(TME)中的潜在作用还不是十分清楚。作者分析了1109例大肠癌(CRC)样本的PRGs的基因组和转录组水平的变化并评估其在4个独立数据集中的表达模式。作者鉴定到2个分子亚型并发现PRG与患者的临床病理特征,预后和免疫细胞浸润有关。作者构建PRG_score预测CRC患者的无复发生存期(RFS)。PRG_score低的患者微卫星不稳定性高(MSI-H),TMB和免疫激活增加,RFS较好。此外,PRG_score与肿瘤干细胞(CSC)指数和化疗药物敏感性显著相关。作者对CRC中的PRGs进行全面分析,表明他们在患者的肿瘤免疫微环境,临床病理特征和预后中具有重要作用。


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流程图

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结果


1. 数据集的获取和下载

从GEO数据库下载GEO CRC数据集,包括GSE39582,GSE17536和GSE38832。从TCGA数据库下载TCGA CRC(COAD/READ)数据集。将这4个数据集合并共包含1109例样本。


2. CRC中PRGs的基因和转录水平变化

本研究共包括48个PRGs。图1a为COAD数据集中这48个PRGs的体细胞突变频率,有297例样本的PRGs发生突变,其中TP53的突变频率最高而NLRP7, CYCS, TNF, PYCARD, PRKACA和CASP6没有发生突变。图1b为READ数据集中这48个PRGs的体细胞突变频率,READ中PRGs的突变频率最高,其中TP53的突变频率最高。随后,作者分析PRGs的拷贝数变异情况。其中GSDMD, GSDMB, GSDMC, HMGB1, CHMP4B和PLCG1的拷贝数变异频率较高,而CASP9,IRF2,CASP3和CHMP7的拷贝数变异频率较低(图1c)。图1d为PRGs发生CNV的位置。PRGs表达水平和CNV频率的相关性分析表明,大部分PRGs的表达水平与CNV频率正相关。发生CNV缺失的PRGs的在正常组织中的表达水平较高(图1e)。这些结果表明在CRC样本和正常样本中PRGs的基因组变异和表达水平均具有显著差异。

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图1 CRC中PRGs的基因组和转录组变异


3. 鉴定CRC中细胞焦亡亚型

为全面鉴定PRGs表达模式涉及的肿瘤发生,作者对CRC数据集进行进一步的分析。单因素Cox回归分析和KM分析筛选到12个PRGs,多因素Cox回归分析筛选到4个PRGs(表1)。PRGs在CRC患者中的交互作用和预后价值如图2a所示。为进一步研究PRGs在CRC中的表达特征,作者进行一致性聚类分析。患者分为两个亚型,分别为亚型A(465例)和亚型B(644例)(图2b)。PCA分析表明两个亚型具有显著差异(图2c)。图2d表明亚型A的RFS更长。不同亚型的患者的临床病理特征和PRGs的表达水平具有显著差异(图2e)。

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表1 多因素Cox回归分析


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图2 PRG亚型分析


4. 不同亚型的TME特征

GSVA富集分析表明亚型A显著富集与免疫激活通路(图3a)。为研究CRC中PRGs在TME中的作用,作者评估两个亚型中22种免疫细胞的浸润水平,两个亚型的大部分免疫细胞浸润水平具有显著差异(图3b)。亚型A中CD4记忆-激活T细胞,CD8+ T细胞,naïve B细胞,激活NK细胞和M1,M2巨噬细胞等浸润水平较高,而亚型B中静息CD4记忆T细胞,记忆B细胞和Tregs等浸润水平较低。亚型A中PD1和PD-L1的表达水平较高(图3c和3d)。使用ESTIMATE计算基质打分,免疫打分和estimate打分,亚型A中TME打分较高(图3e)。

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图3 亚型的免疫细胞微环境的差异


5. 鉴定DEGs

作者对亚型A和亚型B进行差异分析鉴定到409个DEGs并进行功能富集分析(图4a和4b)。细胞焦亡亚型相关基因显著富集于免疫相关生物过程(图4a),免疫和癌症相关通路(图4b)。表明细胞焦亡在TME的免疫调节中起到重要作用。对这409个DEGs进行单因素Cox回归分析,鉴定到129个基因与RFS显著相关。一致性聚类分析将CRC患者分为三个亚型,分别为亚型A-C。KM分析表明亚型B的RFS最差,而亚型C的RFS较好(图4c)。亚型B与TNM分期较高,KRAS和BRAF突变频率更高和复发风险更高有关(图4d)。三个亚型的PRGs的表达水平具有显著差异(图4e)。

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图4 基于DEGs鉴定亚型


6. 构建和验证PRG_score的预后价值

作者基于亚型相关DEGs构建PRG_score。图5a为CRC患者的细胞焦亡亚型,基因亚型和PRG_score分组的比例。对亚型相关DEGs进行LASSO和多因素Cox回归分析,鉴定到7个基因与RFS显著相关。风险打分=(-0.1222*CXCL13)+(-0.6623*KLRD1)+(-0.3369*ICOS)+(-0.1063*MMP12)+(0.5528*DPYD)+(0.2368*ZBED2)+(0.3294*SLC2A3)。三个基因亚型的PRG_score显著不同,其中亚型C的PRG_score最低,亚型B的PRG_score最高(图5b)。细胞亚型的PRG_score的分布如图5c所示。根据PRG_score的中位数将患者分为高风险组和低风险组。风险打分分布和患者的生存时间如图5d和5e所示。PCA分析表明高风险组和低风险组分为两组(图5f)。KM分析表明低风险组的总生存期较好(图5g)。1年,3年,5年和10年的AUC分别为0.701,0.724,0.709和0.778(图5h)。化疗敏感性分析表明低风险组的化疗敏感性较好(图5i)。

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图5 构建PRG_score


为验证PRG_score的预后价值,作者使用测试集和三个独立数据集验证预后模型的价值。结果表明,PRG_score可以准确预测患者的生存期且准确率较高。


7. 验证7个PRGs的表达水平

使用RT-qPCR验证7个PRGs在CRC组织和正常组织中的表达水平,CRC中MMP12,ZBED2和SLC2A3的表达水平较高而CXCL13,KLRD1,ICOS和DPYD的表达水平较低。


8.PRG_score的临床相关性分析和分层分析

随后,作者分析PRG_score与临床特征的相关性。结果表明,III-IV期患者的PRG_scrore较高,TNM分期中PRG_score具有显著差异。年龄,性别,TNM分期和KRAS是否发生突变的患者中PRG_score具有显著差异。


9.高风险组和低风险组TME和免疫检查点水平分析

CIBERSORT分析表明PRG_score与M0巨噬细胞,激活肥大细胞,M2巨噬细胞,CD4+ T细胞,CD8+ T细胞,M1巨噬细胞等正相关(图6a)。PRG_score低的免疫打分较高而PRG_score高的基质打分较高(图6b)。此外,PRG_score中的7个基因与免疫细胞丰度的相关性分析表明,大部分免疫细胞与这7个基因显著相关(图6c),且免疫检查点表达水平在两个亚组中具有差异(图6d)。

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图6 TME和免疫检查点表达水平分析


10.PRG_score与MSI和CSC指数的相关性

相关性分析表明PRG_score低与MSI-H状态显著相关,而PRG_score高与MSS状态显著相关(图7a和7b)。为评价MSI状态对CTC患者的RFS的影响,作者对MSI和MSS组进行KM分析,MSI组的生存期较长。随后,作者分析PRG_score与CSC指数的相关性,PRG_score与CSC指数负相关(图7c)。

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图7 CRC患者中PRG_score的全面分析


11.突变和药物敏感性分析

TMB分析表明高风险组的TMB较低(图7d),表明低风险组可能受益于免疫治疗。PRG_score与TMB负相关(图7e)。体细胞突变分析表明高风险组和低风险组中突变频率最高的10个基因为APC,TP53,TTN,KRAS,SYNE1,PIK3CA,MUC16,FAT4,ZFHX4和RYR2(图7f和7g)。高风险组中APC,TP53和KRAS的突变频率较高,而TTN和MUC16的突变频率较低。药物化疗敏感性分析表明高风险组的shikonin的IC50较低,而gemcitabine和camptothecin等的IC50较高(图7h和7i)。


12.构建列线图

作者基于PRG_score和临床病理特征构建列线图用于预测患者的1年,3年,5年和10年的RFS(图8a),列线图的1年,3年,5年和10年的AUC较高(图8b-8e)。校准曲线表明列线图的预测性能较好(图8f-8i)。

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图8 构建列线图


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结论

作者全面分析了CRC患者的PRGs,揭示其在肿瘤免疫微环境,临床病理特征和预后中的潜在机制。作者基于PRGs构建预后模型可以准确预测CRC的生存情况。此外,作者确定了PRG在靶向治疗和免疫治疗中的作用并强调了PRGs的临床价值,为指导CRC患者的个性化免疫治疗提供新的信息。本研究的局限性在于还需要一定的实验验证证明本研究的准确性。



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