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Cancer Cell肿瘤耐药性研究思路

2021年6月24日,来自美国俄勒冈健康与科学大学奈特癌症研究所的研究者人员,在Cancer Cell(IF=31.743)上发表了题为The AML microenvironment catalyzes a stepwise evolution to gilteritinib resistance的研究性文章,使用多种研究手段,详细介绍了FLT3突变的急白血病 (AML) gilteritinib 耐药性的逐步演变确定AURKB对早期抗性至关重要

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一、研究背景

急性髓性白血病 (AML) 是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤,特征是未成熟成髓细胞的异常增殖,浸润骨髓并破坏正常的造血功能fms相关受体酪氨酸激酶3 (FLT3) 基因的驱动突变是AML中最常见的一种,30%患者发生此现象。gilteritinib是一种口服的强效、选择性FLT3抑制剂。然而,残留细胞会在骨髓微环境中存活。随着时间的推移,这些早期耐药细胞进化出内在耐药机制,导致AML复发


二、研究方法

本研究中,通过整合全外显子组测序 (WES)CRISPR-Cas9 筛选、代谢组学、蛋白质组学、磷酸蛋白质组学和小分子抑制剂筛选(汇集了当前最火的研究手段,“烧钱”666啊),全面分析了早期到晚期gilteritinib耐药性的时间演变

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三、研究结果

1)现象:微环境因素促进早期gilteritinib耐药的发展

为了模拟gilteritinib耐药中的微环境保护,研究者使用了外源性成纤维细胞生长因子2 (FGF2) 和FLT3配体 (FL),以保护细胞避免受多个FLT3抑制子影响。结果显示gilteritinib处理的MOLM14细胞未恢复生长,然而所有补充了FGF2或FL的培养物最终都恢复了生长。这些结果突出了外在生存因素在促进对gilteritinib的早期耐药性方面的重要性。

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2)基因变化:在晚期耐药而非早期耐药中,NRAS突变占主导地位

研究者对晚期gilteritinib耐药的MOLM14 和 MV4;11 培养物进行了WES分析,并在13/15个培养物中发现了激活的NRAS点突变。随后评估了这些突变在长期培养过程中出现的时间。通过Sanger测序,在MOLM14培养物中配体存在4个月时,无法检测到突变。这些结果说明NRAS突变在晚期而非早期耐药中富集。

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3)全基因组CRISPR-Cas9筛选:显示早期抗性比晚期抗性更复杂

为了从基因上寻找驱动抗性的信号通路,研究者在具有代表性的FGF2和FL早期和晚期抗性MOLM14培养物中进行了全基因组CRISPR-Cas9再敏化筛选。FGF2-和FL-依赖性培养物的CRISPR-Cas9分析没有确定导致早期gilteritinib耐药的单个基因,而是揭示了许多参与细胞周期进程、脂质代谢和PI3K/MAPK信号通路的基因。与早期抗性相比,NRAS是迄今为止晚期抗性培养物中最显著的分子。以上结果表明,早期gilteritinib耐药是多因素的,而晚期耐药则表现出对NRAS的依赖性。

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4)代谢组学:早期和晚期gilteritinib耐药细胞表现出独特的代谢依赖性

FGF2和FL早期CRISPR-Cas9筛选出来的多种分子表明,代谢波动可能有助于早期耐药。因此,通过对早期和晚期gilteritinib耐药培养物中代谢物的检测,表明长期FLT3抑制导致广泛的代谢重编程。偏最小二乘判别分析揭示,相对于亲本细胞,早期和晚期gilteritinib耐药的MOLM14培养物中代谢组学存在显著差异。这些结果表明代谢重编程从早期抵抗开始,并持续到晚期抵抗。


5)蛋白组学:早期和晚期gilteritinib耐药培养物具有不同的蛋白质组学特征

为了进一步确定早期耐药性,研究者进行了蛋白质组学和磷酸蛋白质组学,分析表明早期和晚期gilteritinib耐药培养物具有不同的蛋白质组学特征,早期耐药显著降低了细胞周期蛋白的活性。


6)实验验证:早期gilteritinib耐药性依赖AURKB进行细胞周期调节

磷酸化蛋白质组学数据表明细胞周期的改变有助于早期gilteritinib耐药。因此,研究者通过通过定量分析细胞周期、AURKB抑制剂以及CRISPR-Cas9敲除AURKB实验方法,发现早期耐药培养物的细胞周期较慢,AURKB的抑制使早期耐药MOLM14细胞对gilteritinib重新敏感。

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7)临床转化:早期和晚期gilteritinib耐药模型概括了人类疾病

为了评估早期耐药培养物的临床相关性,研究者选择12名接受gilteritinib治疗的AML患者,原发性早期耐药AML样本的靶向蛋白质组学显示细胞周期蛋白减少,脂质代谢蛋白增加,MAPK信号蛋白改变;体外治疗证实AURKB在早期耐药性中的脆弱性。

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四、总结

本研究详细介绍了FLT3突变的AMLgilteritinib 耐药性的逐步演变

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本模型密切反映了接受gilteritinib治疗的AML患者的时间和突变。AURKB的药理学抑制使接受gilteritinib治疗的AML患者的早期耐药细胞培养物和原代白血病细胞重新敏感。这些发现为临床治疗提供了有效策略,即在预先存在的耐药突变扩大之前,用AURKB抑制剂和gilteritinib靶向早期耐药AML细胞。(行文至此,各位看官发现了吗,原来我们走过最深的路,是顶刊的套路啊:现象—机制—临床转化是最基本的思路,运用时下最火的研究方法,瞬间让文章上了好几个档次,然而这些都是白花花的银子呀!So~各位准备发大paper的小伙伴们,准备好“烧钱”了吗~好啦,我们下次顶刊见bye~)


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