这篇文章于2020年7月10日发表在Science Immunology上，题为Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19 ，本文通过对健康人、COVID-19不同症状患者及流感重症患者中收集外周血单个核细胞(PBMC) 进行单细胞分析。研究人员发现，与重症流感相比，COVID-19患者在PBMC中的所有类型细胞中均表现出炎症反应增高的特征，尤其是TNF /IL-1β驱动的炎症反应的上调。在来自重症COVID-19患者的经典单核细胞中，I型IFN反应与TNF /IL-1β驱动的炎症共存，而在轻度COVID-19患者中并不存在。基于此作者提出I型IFN反应在重症COVID-19患者炎症效应中起关键作用。
背景介绍
（1）目前， SARS-CoV-2感染通常症状较轻，但是，有些患者特别是老年患者将发展为重症COVID-19感染，需要机械通气进行重症监护；
（2）COVID-19重症患者往往表现为典型的细胞因子风暴，包括过高的免疫应答，促炎因子高表达（TNF，IL-6），同时伴随免疫功能失调，T细胞耗竭及血管渗漏等；
（3） 在重症COVID-19的患者中，T细胞的绝对数量减少，表现出功能性衰竭，并带有抑制性受体的表达;在致死的COVID-19病例中，也报道了CD38，HLA-DR和细胞毒性分子上调所反映的T细胞过度活化。
研究方案
样本：健康人（n=4），重症流感患者（n=5），COVID-19患者包括重症，轻症以及无症状（n=8）
单细胞建库流程：10X3‘ genomics
测序数据分析介绍
1.工具:cellranger 10X genomics,v3.0.2
2.比对: GRCh38
3.筛选：去除表达少于200基因的细胞以及并不表达的基因，包括线粒体基因表达量大于15%的细胞
4.降维，聚类：Seurat v3.1.5，PCs=15，resolution=0.5
5.差异基因分析：MAST算法
6.GO分析：DAVID
7.伪时序分析：DDRTree
8.GSEA分析：GSEA4.0.3
结果分析
（1）首先，从健康人、流感重症患者以及COVID-19不同症状患者中收集外周血单个核细胞(PBMC)，并利用单细胞RNA测序技术对不同患者细胞进行分析。经过滤后，作者一共捕获59572个细胞，根据标记基因进行标记后，共发现11类主要的免疫细胞类群（图1A-C） ，包括IgG-B细胞、IgG + B细胞、效应记忆（EM）样CD4 + T细胞、非EM样CD4 + T细胞、EM样CD8 + T细胞、非EM样CD8 + T细胞、自然杀伤（NK） 细胞、经典单核细胞、中间单核细胞，非经典单核细胞和树突状细胞（DC）。然后作者调查了疾病组与健康组中免疫细胞的相对比例（图1D和E）。在重症COVID-19中，经典单核细胞的比例显着增加，而DC、非经典单核细胞、中间单核细胞、NK细胞、EM样CD8 + T细胞和EM样CD4 + T细胞的比例显着下降（图1E） 。在严重流感中，经典单核细胞的比例显着增也加，而DC、非EM样CD4 + T细胞、EM样CD4 + T细胞，IgG + B细胞和IgG- B细胞的比例显着下降。
图 1 COVID-19患者与流感患者PBMC单细胞分群比例变化
（2）然后研究者为了比较不同感染的影响， 对差异基因进行层次聚类时发现PBMC能够按疾病分组聚类 ，而不是按照细胞类型（图2A）。该结果表明，在COVID-19中，不管细胞类型如何，外周血免疫细胞都可能受到共同炎症介质的影响。尽管在COVID-19和流感之间有明显的转录特征差异，但重症COVID-19和流感在所有类型的单核细胞和DC中具有共同的转录特征，这可能反映了在重症流感和重症COVID-19在天然免疫方面具有相同的信号通路 。接着研究人员利用GO分析鉴定疾病特异性上调或下调基因的相关生物学功能。直接比较COVID-19和流感时，发现NFKB1，NFKB2和TNF在COVID-19中上调，而STAT1，TLR4和免疫蛋白酶亚基的基因在流感中上调，这表明炎症反应基因在COVID-19和流感中均具有很高的活性。但是转录因子，包括即NFKB1 / 2和STAT4在COVID-19中被上调。与流感相比，在COVID-19中观察到与IFN-I和-II信号传导途径，T细胞受体途径和适应性免疫应答相关的基因响应有限。进一步根据WGCNA分析，发现CD8+ T细胞、NK细胞中NFKB1/2、JUN、TNF模块化，而在单核、DC细胞中IL1B、NFKBID、OSM模块化（图2D）。
图 2 COVID-19免疫相关基因变化
（3）接着，由于CD8+ T细胞在病毒感染中的重要性， 对EM样和非EM样CD8 + T细胞进行了亚群分析（图3A）。在非EM样CD8 + T细胞的6个亚群中，亚群1和亚群3分别主要由流感和COVID-19组构成（图3B和C）。亚群3特异性上调的基因反映了免疫应答的激活，包括CD27，RGS1，CCL5，SELL和RGS10，通过蛋白质互作发现COVID-19中T细胞亚群3中GZMK, GZMA, CXCR3和CCL5的高表达（图3D）。GO分析发现COVID-19中T细胞亚群3中TNF、IL-1信号通路高度活化（图3E）。
图 3 CD8+T细胞亚群分析
（4）使用相同的方法，作者又对经典单核细胞进行亚分群，图4A为流感和COVID-19之间的差异基因（DEG），TNF、IL-1在COVID-19中特异性上调。通过基因集富集分析（GSEA）发现，COVID-19富集通路为TNF/IL-1β信号通路，而流感中则是I型干扰素通路激活，但在重症COVID-19中I型干扰素通路也起到了重要作用。 
图 4 单核细胞亚群分析
（5）紧接着，作者对轻重症COVID-19中经典单核细胞进行比较分析，重症COVID-19中表现为各种ISG（包括ISG15，IFITM1 / 2/3和ISG20）的上调（图5A）。TNF /IL-1β反应性基因和IFN-I反应性基因均在重症COVID-19特异性上调基因中富集（图5B）。然后作者使用monocle 2对轻重症患者进行伪时序分析，发现经典单核细胞沿着病程严重性分布（图5C），在亚群1中主要由重症患者细胞组成，并与IFN-1和TNF /IL-1β相关的炎症反应高度相关（图5D-E）。研究者分析了一个不响应IFN只与TNF有关的基因模块，通过表达模式推测IFN能够通过消除TNF介导的免疫耐受负调节，增强TNF/NFKB通路，促进免疫反应高度活化，并发现该模块在亚群1富集。
图 5 经典单核细胞的伪时序分析
（6）最后作者使用致死性COVID-19患者尸检中的肺组织进行bulk RNA-Seq，验证重症COVID-19中的高炎症反应特征。通常在重症单核细胞中观察到IFITM1，ISG15和JAK3的上调以及RPS18的下调（图6A），并发现IFN-1应答和TNF /IL-1β-炎症应答在肺组织中均很显着（图6B）。
图 6 在致死性COVID-19的死后肺组织转录组中验证IFN-I和炎症反应
参考文献
Lee JS, Park S, Jeong HW, et al. Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19. Sci Immunol. 2020;5(49):eabd1554. doi:10.1126/sciimmunol.abd1554
