今天跟大家分享的是今年6月发表在Molecular Oncology杂志（IF：6.5）上的一篇文章。主要介绍的是cfDNA（游离DNA）为肿瘤基因组图谱的研究提供了一种替代组织活检的方法，通过cfDNA的WGS（全基因组测序）来评估胰腺癌中的CNA（拷贝数改变），并确定它们的临床意义。 Genome-wide profiling of circulating tumor DNA depicts landscape of copy number alterations in pancreatic cancer with liver metastasis 循环肿瘤DNA的全基因组图谱描述了具有肝转移的胰腺癌的拷贝数变化情况 材料与方法cfDNA的全基因组测序研究者对从70例胰腺癌患者中收集的90份血浆样本进行了低覆盖率WGS处理（图1）。每个样本的20ng cfDNA作为文库制备的输入材料，使用Truseq Nano DNA HT样本制备试剂盒生成测序文库，并将索引代码添加到每个样本中。在纯化PCR产物之后，分析文库的大小分布并通过实时PCR定量。文库在Illumina Hiseq平台上测序，通过BWA软件将有效测序数据映射到参考人类基因组hg19上。其中，该高质量数据对读段进行了质控，以进行下游生物信息学分析。体细胞CNA calling及TCGA数据处理研究者使用ichorCNA方法进行了拷贝数分析和TFx（肿瘤分数）估计。具体地说，就是使用HMMcopy Suite中的工具，对基因组读段进行计数，然后对读段的计数进行归一化，以校正GC含量和可映射性偏差，再估计CNA和TFx。另一方面，研究者使用Firehose获得了原发性胰腺癌组织（n=184）的TCGA数据。体细胞CNA数据来源于Affymetrix SNP阵列，并使用预计算的分段log2比率进行分析。基因水平的拷贝数分析研究者使用GISTIC来进行所有基因水平的拷贝数分析。首先对cfDNA和TCGA数据进行ichorCNA分析之后得到了分段数据，经纯度和多倍性校正后再输入GISTIC。该研究的连续参数比较采用U检验，类别变量比较采用卡方检验，采用皮尔逊相关法进行相关分析，生存分析则采用Kaplan-Meier法。结果cfDNA的浅层全基因组测序可实现肿瘤分数的估计基于低覆盖率WGS，在34名受试者中（48.6%）观察到了体细胞CNA。在染色体的局部性、节段性和数量上发现广泛的畸变，个体之间存在显著的异质性（图2A-D）。平均而言，这些病例中分别有23.8% 和22.8% 的基因组出现拷贝数增加和丢失（图2D）。cfDNA的浅层WGS可以通过ichorCNA分析估算TFx。其中，队列中检测到CNA的患者的TFx值为6.1%-75.3%（图2E），而那些没有检测到改变的患者的TFx值为0。先前对当前队列中部分患者的靶向基因组测序已确定了KRAS改变，KRAS的突变等位基因片段与TFx有良好的相关性（图2F）。由于测序深度可能会影响数据解释，而以往的研究大多采用0.1×超低通测序，因此通过比较几个不同的深度来分析患者的拷贝数特征。结果表明，当按上述不同深度进行分析时，每个样本的TFx几乎相同，然而，更高的测序深度产生的基因水平拷贝数图谱的分辨率更好。然后，研究者试图评估CNA检测或TFx>0的临床病理决定因素。结果显示，与未发现CNA的局灶性病变相比，检出CNA的30例患者均显示有肝转移。此外，TFx>0的患者血清常规肿瘤标志物如糖类抗原19-9（CA19-9）水平明显高于TFx=0的患者。而人口统计学因素、组织学和放射学特征与TFx增加无关。较高的TFx与总生存期缩短有关（图2G），并且是唯一具有统计学意义的预后因素。cfDNA分析推测转移性胰腺癌的CNA图谱为了确定转移性胰腺癌的染色体改变模式，研究者选择TFx>10%或含有CNA的cfDNA样本进行高置信度拷贝数调用（n=34）。另一方面，进一步纳入了TCGA数据库中原发肿瘤组织的患者，以比较原发性胰腺癌和转移性胰腺癌的拷贝数特征。结果显示，与原代相比，不论拷贝数增加还是丢失，转移性胰腺癌的基因组百分比明显增加（图3A）。总体而言，这两组之间改变的基因组区域在染色体和基因水平上基本一致，但大多数区域在转移组中显示出比原发组更高的CNA频率（图3B）。在单个基因水平上，胰腺癌相关基因的子集在转移患者中的改变频率明显更高，包括KRAS和MYC的增加，以及TGFBR2和PBRM1的缺失等（图3C-D）。血浆和配对肿瘤组织中CNA的评估研究者还对6例患者的血浆标本和肿瘤组织中的CNA进行了比较。在第1例中，同时获得了肝转移组织和血浆，尽管cfDNA的TFx较低，但拷贝数分布几乎相同（图4A）。其余5例是接受手术切除后发展为肝转移，对其原发性肿瘤组织的CNA和术后cfDNA进行了比较，其中2例由于肿瘤细胞密度低，ichorCNA分析估计的TFx为0。对于剩下的3对，观察到2个受试者的组织和血浆之间的轮廓有很强的一致性（图4B），但是与组织相比，cfDNA中的CNA有所增加。在最后1例中，cfDNA的CNA图谱与组织来源的DNA相比有明显的差异，其区域改变更大。这些数据暗示了在胰腺癌转移过程中，与CNA相关的基因组进化的可能性。cfDNA图谱与肿瘤基因组进化为了探索化疗后的基因组进化和潜在的耐药机制，研究者对14例患者进行了纵向ctDNA分析。cfDNA图谱显示TFx的动态变化与13例患者的临床反应一致。相反，对于最后1位患者，尽管化疗后肿瘤负担增加，TFx却有所降低（表1）。使用上述样本对进行化疗暴露后，全基因组范围内的拷贝数分布没有明显改变。值得注意的是，CNA的高丰度与化疗的良好反应有关，而TFx与治疗反应无关。为此，研究者进一步验证了2个案例，分析了多个血浆样本。第1例患者最初对FOLFIRINOX（一种化疗方案）表现出良好的反应，但经过6个周期的治疗后病情恶化，这一临床背景与TFx和KRAS突变等位基因比例的动态一致（图5A）。在第2例中，FOLFIRINOX治疗后病情持续恶化，TFx的动态变化与持续升高的临床表现一致（图5B）。在这2名患者的整个治疗过程中，CNA的特征几乎相同（图5A-B）。
