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解读,scRNA-seq分析鉴定半月板祖细胞并揭示半月板变性的进展

文章信息

文章题目:Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration
期刊:ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES
发表日期:2019年12月
DOI: http://dx.doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-215926

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摘要

解决问题:半月板细胞的异质性以及半月板变性的机制尚不清楚

方法:利用scRNA-seq鉴定健康人和变性半月板细胞的细胞亚群及其基因特征,以确定它们的分化关系,并表征特定细胞类型的多样性。采用集落形成、多分化试验和小鼠半月板损伤模型鉴定半月板祖细胞。通过计算分析和实验验证,研究了退行性半月板祖细胞簇在半月板变性过程中的作用。

结果:在健康人半月板中确定了7个群,包括5个经验定义的人群和2个新人群。伪时序分析显示在伪间隙轨迹开始处存在内皮细胞(EC)和纤维软骨细胞祖细胞(FCP)。黑色素瘤细胞粘附分子((MCAM)/CD146)在两个簇高表达。CD146+半月板细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞并形成群落。鉴定了退行性半月板细胞群的比例变化,并发现了一种具有祖细胞特征的退行性半月板细胞群。4个祖细胞簇的重组表明FCP向DegP的分化是一个异常的过程。白细胞介素1β刺激健康人半月板细胞增加CD318+细胞,而TGFβ1抑制退化半月板细胞CD318+细胞的增殖。因此半月板祖细胞的鉴定为基于细胞的半月板组织工程提供了新的视角,揭示了一种新的半月板退行性机制,有助于开发一种新的治疗策略。

这里需要为大家普及一些半月板细胞特征

半月板细胞:半月板的细胞类型是异质的,其中内部区域包含软骨细胞样形态细胞,而外部区域包含成纤维细胞样细胞。最近,建议在半月板中存在干/祖细胞以促进半月板损伤修复。Gamer等人通过体外半月板外植体培养分离了半月板干/祖细胞,表征了这些细胞的克隆形成特性,并大量表达CD44和Sca-1。然而,半月板中的细胞类型组成和细胞分布,以及用于组织工程的半月板干细胞/祖细胞的生化标记仍有待阐明。

退行性半月板和膝骨关节炎(OA)之间的关系很复杂。半月板退行性撕裂被发现与同一间室的软骨丢失增加相关 , 尤其是后角撕裂 。Fuller 等人发现在羊的体外模型中发现内外区半月板细胞都对炎症因子IL-1α和TNF-α有反应 , 这将会导致细胞因子诱导的胶原分解和聚集分解 。这些研究证明了退行性半月板在骨关节炎发展中的重要性及其对关节疾病的总体影响。退行性半月板伴有水含量增加了湿重,而胶原蛋白和总糖胺聚糖(GAG)减少了。然而,退行性半月板治疗的细胞类型及其生物学标志物的种类,以及生物学靶点的种类尚未完全确定。

测序数据介绍

  • 测序样本:健康半月板样品   退变半月板样品
  • 测序平台:BD Rhapsody
  • 测序数据量:100G
  • 测序数据:GSE133449

作者将人的半月板组织从滑膜切开,然后切成小块。接下来,将这些小碎片用4 mg / mL蛋白酶(Roche 11459643001)消化1小时,并用2 mg / mL胶原酶P(Roche 11213873001)消化6-10小时。

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在这里我们介绍一下BD Rhapsody平台

BD Rhapsody核心技术 :BD Rhapsody利用微孔进行单细胞分离,属于Micriwell-seq。20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead(磁珠),bead上连接逆转录引物,引物主要包括以下几个部分:

  1. CL(cell label,细胞标签),一个磁珠上的引物CL序列相同,不同磁珠上的引物CL序列不同,从而达到区分序列的作用
  2. UMI(unique molecular identifier),一个磁珠上的引物UMI各不同,可以区分最初的mRNA分子,以便后期分析时消除扩增带来的偏差
  3. poly dT,和mRNA 3'端poly A互补配对。同时悬液被稀释到适当浓度,微孔随机捕获单细胞,单细胞捕获率为80%,捕获1K个细胞出现的多细胞比率约为0.2%,捕获10K个细胞多细胞比率约为2.4%。Rhapsody建议检测通量为100-10000

结果解读

对健康人群半月板细胞组成进行研究

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对3例正常人样本进行scRNA-seq,并对3639个细胞进行了t-SNE分析,有图可知可分为七个亚群

细胞细胞marker
内皮细胞(EC)CD93、CDH5
软骨细胞祖细胞(CPC)CDK1、BIRC5
调节性软骨细胞(RegC)BMP2、FOSL1
纤维软骨细胞(FC)COL1A1、COL3A1、COL6A1
预肥大细胞(PreHTC)MMP1、TNFAIP6
纤维软骨细胞祖细胞(FCP)COL1A1、COL3A1、MCAM、MYLK
增殖纤维软骨细胞(ProFC)COL1A1、FGF7、CTGF

作者在这里采用热图与免疫组化相结合的方式干湿探索不同簇的差异表达和差异分布情况,基于先验知识得出符合预期的结论,这样可以使得后续研究更加有的放矢。

人半月板祖细胞鉴定

作者也是采用常规的 Monocle 来进行轨迹分析,由轨迹分析我们可以清楚的看到 EC和FCP存在于伪空间轨迹的起点

随后作者主要研究了FCP,随后对FCP的通路富集,以及分析到FCP表达了间质干细胞标记物MCAM (CD146),以及肌成纤维细胞的经典标记物,包括ACTA2、MYLK和MYL9。之后使用荧光激活细胞分选法(FACS)分离CD146+原代人半月板细胞,发现CD146+原代人半月板细胞的比例接近2.7%。CD146+细胞具有分化为各种细胞谱系的能力,包括成骨细胞和脂肪细胞。接下来,对CD146+细胞进行克隆性实验,CD146组细胞能够形成菌落的事实表明,另一个细胞簇也可能具有祖细胞的特性。CD93是ECs的特异性标记物,因此采用流式细胞仪(FACS)获得CD146+/CD93+半月板细胞(EC)和CD146+/CD93半月板细胞(FCP)。进一步的实验表明,这两个簇具有祖先属性 。

单细胞轨迹分支点对应于FCP分化

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为了研究FCP分化成亚群和相应的基因表达,作者选择FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC构建一个包含两个终端的新轨迹,对应两种不同的细胞分化命运。轨迹的根主要由FCP和ProFC填充,而树的两个端点由FC和PreHTC填充fate 1, RegC和PreHTC填充fate 2。接下来,作者评估了FCP分化过程中细胞中命运轨道1和2处受调控基因的表达。MYLK、CNN1、FGF7和COL1A1的表达相似。而MYLK和CNN1的表达从根部到两种命运均显著降低 , FGF7和COL1A1的表达在FCP分化早期上调,而在向两种命运分化的细胞中下调 。ADAMTS4和MMP1在细胞分化早期轻度上调,在fate 1中显著上调,在fate 2中显著下调 。相反, FOSL1和BMP2的表达在根部到fate 1的细胞中略有下降,但在通过fate 2分化的细胞中显著增加 。(如果这里有些不太清楚建议画表)

接下来为了验证这样的轨迹分类是正确的,作者在小鼠半月板中进行了免疫组化实验。随着年龄的增加,MYLK的表达量显著降低。这些表达模式与两种不同的轨迹命运一致,表明scRNA-seq分析与半月板发育过程相关 。

健康人半月板和退行性半月板单细胞景观的系统比较

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接下来,作者比较了健康半月板和退行性半月板的scRNA-seq, 发现退行性半月板细胞团簇的比例发生了显著变化,包括三个新的团簇:

  1. 单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC,表达CD14和S100A9)
  2. 肥大软骨细胞(HTC,表达CCL20和EREG)
  3. 退行性半月板祖细胞(DegP)

之后使用流式细胞术检测CD146和CD318在健康人半月板细胞和退行性半月板细胞中的表达, 并对COL1A1和COL2A1健康人体半月板和变性半月板进行具有代表性的免疫组化染色,并对阳性细胞进行定量。最后采用qRT-PCR检测人健康半月板细胞和变性半月板细胞中指示标记基因的表达。在这一部分主要是由差异细胞到差异基因的探究,从基因层面解释差异现象

单细胞轨迹的排列表明DegP是半月板变性的关键因素

CDCP1 (CD318)在DegP中高表达

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因此,作者通过流式细胞仪分离CD318+原代退行性半月板细胞,验证其祖细胞能力。发现CD318+细胞形成菌落并分化为多种细胞系,其中DegP是一种具有祖细胞特征的特殊群体,主要存在于退行性半月板中。接下来,选择了4个具有祖先属性的簇:FCP、ProFC、CPC和DegP,构建一个新的轨迹。轨迹的根主要是通过FCP和ProFC填充,而树的两个主要的末端被由DegP和CPC填充fate 1,和CP填充fate 2。尽管MCAM和MYLK在轨迹根部高表达 , 它们的表达沿着根显著减少,直到fate1和2 。BIRC5和CDK1在fate 2末端高表达 , 而GAS1、RAB3B和CDCP1在fate 1末端高度表达 。然而,在正常的FCP分化过程中,GAS1、RAB3B和CDCP1的表达在从根向fates 1和fates 2的过程中显著降低 ,表明命运1可能是一个异常的细胞状态在半月板退行性过程。

免疫组化染色验证了标记基因的表达。FCP标记基因MYLK在变性半月板中表达下调,而DegP标记基因GAS1和DNER在变性半月板中表达上调,特别是在半月板病变伴有细胞增殖的区域。随后作者使用IL-1β(5 ng/mL)刺激健康人半月板细胞48小时和96小时。结果提示,IL-1β等多种致病因子导致的CD146+细胞减少、CD318+细胞增多可能是半月板变性的重要机制。

TGFβ信号通路的激活可减弱变性半月板中CD318+细胞的增加

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已有研究表明,TGFβ信号的激活可增强半月板祖细胞的分化能力。我们的scRNA-seq分析和免疫组化染色显示,转化生长因子β(TGFβ)信号通路配体TGFβ1在健康半月板细胞中高表达 。作者之后还比较了FC-1和FC-2、PreHTC-1和PreHTC-2这两种细胞类型在健康和退行性半月板中的基因表达差异。与主要存在于退行性半月板(FC-2和PreHTC-2)的集群相比,健康半月板(FC-1和PreHTC-1)的集群通过TGFβ信号通路上调并且高度表达COL1A1 COL3A1 TGFβ1。接下来,作者研究了在DegP转化生长因子β1的影响。流式细胞术证明TGFβ1治疗显著降低CD318 +细胞的数量并且呈现时间依赖性和 qRT-PCR结果显示,TGFβ1处理显著提高了COL1A1、COL3A1和CDK1的表达,降低了CD318、S100A9、MMP1和MMP3的表达 ,表明TGFβ1可能会推迟半月板的退化

总结

这篇文章是一个很好的干湿结合文章,首先通过单细胞测序入手,运用t-SNE进行分析,以生物信息学分析来与先验知识做预测。从健康半月板与退行性半月板差异入手,由细胞分析进而研究其marker变化,最终由通路收尾。这篇文章在单细胞方向上比较基础,参照单细胞天地公众号与GEO数据完全可以复现,在实验方面也并不是非常复杂,大家需要再总结一下这篇文章的规律,之后运用这篇文章的科研方法解决自己的问题。


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