非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中非常常见的一种，其中EGFR基因突变是导致NSCLC的病因之一。针对EGFR突变的治疗靶向药物——TKI抑制剂在近几年已经得到广泛的使用，并获得了不错的疗效。然而，耐药性成为了靶向药物治疗癌症的一大障碍。NSCLC肿瘤细胞产生耐药性的原因很多，大体上可以总结为EGFR的下游通路基因被另一种方式激活。然而很多情况下患者产生的耐药性包含多个机制，这些机制的具体原因不明，因此难以开发有针对性的治疗策略。本文通过CRISPR/Cas9筛选耐药肿瘤细胞中除EGFR以外的差异基因和通路，由此作为应对耐药性治疗的理论依据。

1. 全基因组CRISPR/Cas9筛选EGFR突变的NSCLC中调控EGFR TKI（靶向药物）敏感性的基因

首先作者使用了EGFR突变的NSCLC细胞系HCC827，并将其分为药物敏感和药物抵抗细胞进行CRISPR筛选。筛选得到的基因通过STRING进行网络分析，得到若干基因富集通路。

2. 调控EGFR TKI敏感性候选基因的验证

分别设计上述筛选到的候选基因的sgRNA，重新构建CRISPR/Cas9基因敲除的HCC827细胞并进行细胞克隆实验验证药物敏感性，进一步缩小目标基因范围。

可以看到，RIC8A、YAP1、PKN2、GNB2（敲除后对药物敏感）和ARIH2、CUL5、RNF7、BTAF1（敲除后对药物耐受）都是有非常明显表型的基因。

3. 在EGFR突变的RIC8A敲除NSCLC细胞中使用EGFR抑制剂导致细胞合成致死

在这些候选基因中，作者把关注点放在了比较著名的RIC8A上。在不同形式的EGFR突变细胞中敲除RIC8A，都表现出HCC827细胞对药物的敏感性，在使用药物后RIC8A敲除细胞生长被显著抑制，EGFR下游通路基因表达显著降低。

4. 敲除RIC8A减弱EGFR突变的NSCLC细胞中YAP通路介导的肿瘤细胞增殖

做完RIC8A的功能验证，就要做具体的分子机制。已有文献报道YAP是RIC8A的下游通路之一，因此作者通过检测RIC8A敲除细胞中YAP下游调控基因的表达量，以及YAP功能回复实验验证RIC8A通过YAP调控肿瘤细胞增殖这一机制。通过对以往研究的调查作者推测RIC8A可能通过 Gα-Rho/Rac信号轴影响YAP，简单验证一下，RIC8A/Gα/RHOA/YAP这条信号轴算是连通了。（这里的机制研究确实做得浅了些）

5. 体内外实验验证ARIH2缺失导致EGFR TKI耐药性

验证完对药物抵抗有正向作用的基因，作者又将目标转向抑制耐药性的基因ARIH2。实验方法和之前类似，但这里作者还增加了小鼠移植瘤实验观察体内情况。结果证明，敲除ARIH2对细胞活力没有影响，但是细胞的耐药性增加，表现为使用药物后细胞增殖显著高于对照组。

6. ARIH2通过调控METAP2表达量影响肿瘤细胞耐药性

为了找到ARIH2调控细胞耐药性的分子机制，作者对ARIH2敲除细胞做了蛋白组分析。结果发现了三个显著高表达的蛋白METAP2、ALDOA和PSAT1。在肿瘤细胞中过表达METAP2，肿瘤细胞耐药性增强，而敲除ARIH2后细胞中METAP2的蛋白含量增加。同样过表达ALDOA和PSAT1，肿瘤细胞耐药性增强。然而，作者并没有找到ARIH2调控METAP2的直接分子机制。

这篇文章在机制上研究不够深入，只是根据以往研究推测和验证了一下筛库所得的基因对EGFR突变细胞耐药性的影响。然而，对于一篇CRISPR筛选的文章来说，从筛库到体内外验证，整个过程还比较完整，临床意义也比较充分。如果大家对于分子机制的研究不擅长，倒是可以考虑学习一下这篇文章的方法，从工作量到难易程度都比较适中，适合想要做影响因子5-10分文章的小伙伴参考。

最后，还是放上CRISPR/Cas9文库筛选流程方便大家理解。