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单细胞测序类国自然申请思路

单细胞测序允许我们在单细胞水平上解决相关问题,比如单细胞内RNA测序,DNA甲基化测序,染色体构象 (ATAC-seq)等等。国自然申请中单细胞测序的内容越来越多。


传统方法只能分析整个细胞群体,得到的是一个整体检测的平均值,并不能代表每个单细胞的水平。就比如图1,传统方法得到左边的“果汁”,而实际上果汁是由右边多个“单水果”组成的。


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图1(图片来自网络)


那么如何进行单细胞测序类的研究课题呢?我们从国自然成果共享网站(output.nsfc.gov.cn)上可以借鉴他人的研究思路。




思路一 病例对照研究,发现差异,寻找调控基因的转录因子


比如《利用单细胞转录组分析技术对肿瘤内部异质性的系统研究》(批准号,81472855,H1826)。该面上项目以肝癌组织为研究对象,单细胞转录组学分析细胞基因表达的异质性。然后使用生物信息学预测调控各个细胞亚群的转录因子。最后通过功能试验,研究各个细胞亚群的表型差异以及转录因子的调控作用。

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思路二.  病例对照研究,发现差异,细胞谱系分化,临床表型相关性


再举一个例子,《基于单细胞转录组测序的垂体腺瘤增殖异质性评价及与侵袭表型相关性研究》。这个面上项目课题也是”病例对照”研究,以临床标本垂体腺瘤为对象,在经典思路(单细胞测序了解肿瘤的异质性)的基础上,突出了与第一个课题不同的两点:

1.强调了解肿瘤内部是否存在干细胞特性的细胞亚群及其谱系分化特性。

2.将单细胞转录组的差异和临床表型(侵袭)进行相关性分析。

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随着单细胞测序技术越来越广泛的应用,仅仅通过病例对照研究发现组织异质性的课题创新性已经不足。




思路三.  单细胞多组学整合。多时间点观察变化。


还有一种思路是多个单细胞测序技术整合分析的研究。比如《基于单细胞组学数据研究早期胚胎发育中表观遗传模式的建立》。就是以斑马鱼早期胚胎为对象,整合甲基化和核小体定位两种单细胞测序技术。在合子型基因组激活前后动态的观察两种表观遗传信息的改变。当然,这样的研究重点关注于一种模式的动态改变,需要一定的生物信息学和技术背景。

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思路四.  仅以单细胞测序为一种技术手段,发现差异基因,研究上游调控和下游功能。


前较为常见的,还是侧重传统的分子生物学试验。仅仅以单细胞测序为一种技术手段,筛选出差异表达的基因(可以是病例对照,也可以是不同时间点,也可以两者结合),然后侧重于该分子的功能试验。


比如,《单细胞测序鉴定猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的长链非编码RNA及其功能研究》。这里,申请者在不同时间点测定猪的卵子和早期胚胎中的lncRNA,对于筛选出来的lncRNA 进行过表达或者敲减等下游功能试验。

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那么如何研究差异基因和表型之间的关系呢?


举个例子,这个国自然面上项目《线粒体膜蛋白prohibitin调控人精子运动的机制研究》。这里基因(A)就是线粒体膜蛋白prohibitin。表型(B)就是精子运动。


(1)研究基础:  申请人前期研究表明,精子运动与线粒体膜蛋白prohibitin表达下降有关。

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那么接下来,就像赵本山的小品,把一只大象(A)放进冰箱 (B) 中间其实要有好几个层次步骤。



(2)机制:
第一个层次,A通过什么生理功能影响了B。
prohibitin是线粒体膜蛋白,那么常见的思维就是,prohibitin(A)通过影响了线粒体功能而影响了精子运动(B)。这里申请者罗列了各种线粒体功能(线粒体活性氧水平、膜去极化、呼吸状态和脂质过氧化程度,线粒体呼吸链复合体I和III活性),以及其检测手段(荧光探针和流式细胞术,分光光度法)。这里的内容显示了申请者对目标生理功能的研究广度。

第二层次,A通过什么分子机制影响了B。
刚才第一个层次生理功能是在细胞层面,那么在分子层面又是如何呢?这里的分子机制最好是通过测序或者生物信息学分析得到的假设,也可以是选择一条明星通路,比如这里的PI3K/AKT通路。这里申请者假设prohibitin通过PI3K/AKT通路调控人精子运动。
首先了解相关性,PI3K/AKT在弱精症和正常人中有没有差别,然后通过高表达prohibitin(A),看是否能够改变PI3K/AKT通路和精子运动(B)。然后使用PI3K抑制剂,看抑制了PI3K之后 prohibitin(A)对精子运动(B)还有没有作用。研究结果可以明确prohibitin是否通过PI3K/AKT调控人精子运动,为男性不育诊治提供新的分子靶标和理论依据。这里撰写的内容显示了申请者对研究内容认识的深度。
选择明星通路有利有弊,有利之处在于明星通路的作用已知,容易说服审稿人。但是弊端也是很明显的,就是创新性不足,所以这里的推论最好是基于自己的预实验结果。
面一个例子,《Fam71d基因在精子运动中的作用及其分子机制》。

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研究基础 : 申请者前期研究,认为Fam71d(A)和精子运动(B)有关。FAM71D抗体可显著抑制人和小鼠的精子运动。
机制:接下来,申请者准备在整体水平敲除FAM71D,然后检测检测小鼠生育力和精子运动能力。以进一步确定A和B之间的联系。那么A是通过什么机制影响了B呢?在这里申请者引入了另外一个明星分子(钙调蛋白)。为什么引入钙调蛋白呢,因为已知钙调蛋白和精子运动(B) 有关。申请者拟在整体水平敲除了FAM71D基因,看小鼠精子中钙调蛋白的改变。
FAM71D有没有可能通过其他机制比如前面一个课题的线粒体功能影响精子运动呢?当然有,只不过需要实验来检验这个假说罢了。

最后一个面上项目,《RNA酶T2对人精子运动作用机制的研究》。
RNA酶T2(A)和精子运动(B)。
研究基础:正常男性和弱精症患者RNA酶T2表达的差异。RNA酶T2抑制精子运动。
机制:RNA酶T2下游的信号通路(分子机制)。过表达RNA酶T2对精子运动(生理功能)的影响。

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总结,由此可见,我们通过单细胞多组学数据整合,可以发现差异基因的时空改变,并深入研究其下游功能及上游调控因素。


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