CAR-T在细胞治疗领域备受瞩目，通过将嵌合抗原受体（CAR）导入T细胞，极大地改善了临床对肿瘤的治疗效果。

CAR-T的大获成功的同时也加速了CAR-Treg向临床转化的进展。

通过CAR技术，CAR-Treg能够绕过MHC限制性和提高治疗靶向性，在自身免疫性疾病及抑制物抗宿主病（GVHD）中表现出很好的治疗潜力，目前已有多家公司参与开发。

然而，尽管CAR-T对肿瘤疗效非常好，但由于生产成本极高，所产生的昂贵治疗费用让普通患者只能望而止步，CAR-Treg自然绕不开这个难题。

人们一直在积极寻找CAR-T工艺优化手段，以期改进疗效的同时减少生产成本，进而推动其市场化进程。

同样，CAR-Treg的生产也大致可以分为以下步骤：

获取细胞，分选富集 → 活化 → 基因传递 → 扩增 → 质检、储存、运输、回输

1. 采集，分选富集：

CAR-Treg以单采和来自外周血单核细胞（PBMC）为原料，主要也是通过磁珠细胞分选(MACS)，获得维持免疫耐受的主要亚群：CD4+CD25highFoxp3+Treg。

• 目前CAR技术细胞来源均为自体细胞，Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5-10%，部分疾病患者Treg含量更低，甚至在之后表现出无法扩增。

• 原材料无法标准化，细胞活力不可控，以及最主要的个性化定制均为造价昂贵的原因，因此细胞健康人的Treg细胞捐献是未来趋势。
• 以及通过CAR-Foxp3共载体转染可以将CD4或CD3T细胞转化为Treg，这也可以解决外周Treg细胞数量少和内源性TregFoxp3表达不足的。
  
  

Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.

2. 基因导入：

通过慢病毒转染，将CAR基因传递到Treg细胞中是目前最主要基因导入方式。

• 该方法两个词总结：高效，昂贵。

  病毒载体生产耗时耗力，并且有引起炎症反应和基因插入的致癌风险。

  
  

• 电穿孔技术是应用广泛的非病毒转染策略之一
  通过短的脉冲使细胞产生短暂通透性，允许目的基因DNA或mRNA进入。但是这种方法容易引起细胞应激。
  
  
• "sleeping beauty"转座子系统（SB）
  将CAR转基因插入转座子序列中，再将相应质粒和转座子酶（hsSB）一同导入细胞，hsSB会将序列切下来整合到T细胞基因组，该技术整合效率接近病毒。
  
  

而且相较于病毒载体，SB系统在转染后质粒水平逐渐降低。而且质粒相对容易设计，在基因破坏方面也有很高的安全性。

• 原料Treg获取量非常少，所需达到治疗标准的CAR-Treg量非常大，而且考虑储存运输过程的消耗，相较治疗量产品药甚至需要近100倍的数量。

• 扩增所需培养基中必须加入胎牛血清或人血清，使用无血清培养基不但能够节省成本，并能降低外源物的污染。

• 扩增过程包含多种需人工变异操作，需要考虑多种外接因素的影响。

  (如温度、湿度、气体张力、无菌性等)

  作为未来各行业的发展趋势，人工智能(半)自动化及封闭性系统在保证操作精细度的同时能确保环境参数稳定，在提高产量的同时大大降低批次间差异。

5. 质量检测：

用于CAR-Treg的QC检测标准化尚且未制定。

常通过流式细胞术对CD4⁺CD25^highFoxp3⁺Treg进行验证，并辅以Foxp3启动子区域的甲基化分析。

常规观察Treg对Tconv的抑制作用非常耗时，而且对体内的预测价值不大。

Foxp3对Treg在治疗过程维持表型而不会向Teff转化至关重要，添加雷帕霉素能够通过抑制mTOR通路维持Treg稳定性。或者基于CRISPR/Cas9的表观遗传编辑也可能是维持Treg表型的手段。

1. ‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/

2. Fritsche E et al. Toward an Optimized Process for Clinical Manufacturing of CAR-Treg Cell Therapy. Trends Biotechnol. 2020 Oct;38(10):1099-1112.

3. Abou-El-Enein M et al. Scalable Manufacturing of CAR T cells for Cancer Immunotherapy. Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.

4. Arjomandnejad M et al. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells: Engineering and Applications. Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.

5. Querques I et al. A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.

6. Diaconu I et al. Inducible Caspase-9 Selectively Modulates the Toxicities of CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells. Mol Ther. 2017 Mar 1;25(3):580-592.