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动物实验取样细节

对于动物实验,动物取样是少不了的,它是我们的动物实验中很关键的一步:直接影响一个实验能否获得漂亮的数据,发表高分文章。


很多情况是这样的:前期工作已完成得很好了,可由于最后一步取样时的疏忽大意,造成最后实验不可用,所有的努力白费,得重新来过。

今天小编就来整理一下,动物实验过程中取样及注意事项,一起来涨知识吧!

实验样本分类

实验一般采取样本有:血液样本、组织样本和细胞样本。

通常,组织样本采集后,应立即用等渗溶液(PBS或生理盐水)尽量把血液漂洗干净(除非血液也是分析对象),用滤纸或纱布吸干,把样本分切成几分,每份的体积约2个黄豆大小,每份用一个管子装。

血液样本的采集应根据不同实验的要求,将会采取不同策略。


血清样本:全血中不加抗凝剂,血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黄色透明液体。(全血标本室温放置2小时3000rpm/min离心15min)


血浆样本:全血中加抗凝剂,血液凝固后取出的含凝血因子的淡黄色透明液体。(可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2-8℃,3000rpm/min离心15min)


  • 如果是做生化\ELISA等检测可以考虑血浆和血清,根据获得的样本量可考虑分装成100-500μl/管,可避免反复冻融造成的检测误差。

生化:建议优先选择血清,其次选择肝素抗凝血浆;


ELISA:建议优先选择血清,其次选择肝素或EDTA抗凝血浆;


凝血实验:只能选择枸橼酸钠抗凝血浆;


血常规:只能选择EDTA抗凝全血;
  • 如果要收集其中的白细胞、血小板等建议用抗凝全血。


  • 如果要做流式建议用专门的流式用血液收集管,防止表面抗原的丢失,或者尽快安排就近检测。


样本处理

取样完后,应根据所检测指标的要求,需采取不同策略处理。

在如今分子生物学当道的现实背景下,动物实验除了对实验动物的体征及生理指标进行全方位的监控外,各种分子检测甚至是组学检测也开始大行其道,动物实验结束之后的机制研究成为了实验的重头戏。

一般来说,动物实验检测对象主要包括:

(1)体液中各类因子定性及定量检测

由于此类检测对象多为蛋白及各类小分子物质,因此在取样过程中应注意防止此类物质降解,在获取后,应及时置于超低温(≤-80℃)进行保存,在后续实验过程中,也应当注意保存条件的稳定性,避免反复冻融。

最常用的方法便是酶联免疫吸附测定(ELISA),除此之外,可利用生化分析仪及不同检测方法的试剂盒(比色法、比浊法等)方法对各类生化指标及因子进行定性及定量检测。

(2)组织器官病理、生理变化及免疫组化检测

常用的病理检测多使用H&E染色对细胞质及细胞核进行染色标记,以观察细胞变化。除此之外,许多特殊染色也在病理生理变化中得到了广泛应用,如利用Masson染色检测组织纤维化病变,Nissl染色检测神经元损伤,β-半乳糖甘酶染色检测细胞衰老等。

此外,还可以通过免疫组化技术对某些特异性标记物进行免疫显色检测,达到原位定性或定量检测的目的。

(3)基因/蛋白质表达定性或定量检测

在进行分子检测的过程中,保持核酸和蛋白质的完整性至关重要,因此在取样过程中,应尽量避免核酸及蛋白质的降解。如不注意采样过程,将会导致样本中的核酸及蛋白质的无差别降解,严重影响后续分子检测结果。

  • 在条件允许的情况下,组织样本在离体后应立刻装入冻存管内,并立即放入液氮中进行冷冻。

  • 在RNA提取样本的保存过程中,可以选择非冷冻型RNA保存液或Trizol试剂进行RNA酶的抑制。

  • 针对蛋白质提取样本的保存,我们同样可以使用商品化的蛋白酶抑制剂进行短期处理。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及免疫印迹(Western blotting,WB),这两种实验手段是分子生物学检测中不可或缺的一部分,也是发表论文至关重要的分子检测数据。PCR主要用来对基因在基因组层面或转录层面的变化进行定性或定量检测,而WB则主要用来对某一蛋白质的表达进行定量检测。

(4)转录组学、蛋白质组学及代谢组学检测

随着检测水平及相关产业的不断发展,各类组学检测的价格大大降低,实验设计中也常常运用组学检测来提升实验设计的档次。在我们进行转录组学及蛋白质组学的检测过程中,同样是要首先确保目标RNA或蛋白质的片段完整性。

代谢组学的研究对象大都是相对分子量在1000以内的小分子物质,因此常用的血液样本在取样后,应小心操作,防止溶血,尽快分离出血清,分置于超低温环境下保存。

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由于用于病理实验的动物组织采集相对其他样品的采集,操作更繁琐,在处理过程中许多细节容易忽略,造成数据不完美(甚至不能用)。因此接下来将重点介绍组织样品采集的注意事项及其固定。

组织样品采集注意事项

  1. 组织应新鲜,操作时间尽可能短,否则细胞发生死后变化、自融及腐败现象。最好是动物心脏还在跳动时采集,样本取出后最好在5分钟以内置于固定液内,避免长时间暴露在空气环境中。

  2. 组织块尽量小而薄。组织块的厚度以不超过5mm为宜,较为理想的厚度为2mm左右,主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。

  3. 勿使组织块受挤压。在采集过程中,应尽量选择较为锋利的手术器械,如手术专用刀片等,避免操作过程中挤压挫伤标本。挤压过的组织均不可用。固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜,组织能够在容器内自由移动最佳。

  4. 尽量保持组织的原有形态。新鲜组织经固定后,或多或少产生收缩现象(如胃肠),为此可将组织展平,以尽可能维持原形。

  5. 保持组织清洁。组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等,可用生理盐水冲洗,然后再入固定液,但要注意防止组织损伤。

  6. 熟悉采集部位。要能准确的按解剖部位采集,如胰腺,一般取胰岛较多的胰腺尾部;肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。如果实验需进行多组织样本的采集,采集顺序应按照:消化器官,神经系统器官,皮肤,肌肉等的顺序进行。

  7. 选好组织块的切面。熟悉某些器官组织成分安排,然后决定其切面的走向;如一长管状器官以横切面较好。

  8. 切除不需要的部分。特别是组织周围的脂肪等,应尽可能清除掉,否则给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。


组织样品的固定

(1)固定的方法:

①小块组织固定法:从动物取下的小块组织,立即置入液态固定剂(这是应用最广泛最经常的方法)。

②注射/灌注固定法:某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定,这时宜采用注射固定法,将固定液注入血管,经血管分支到达整个组织和全身,从而得到充分的固定。

另,空腔组织比如肺,肺内含有空气,固定液难以渗入,建议先做肺灌注,使得肺充盈满固定液以后再进行保存,如果空腔中气体没有有效排出,后续可能影响固定效果(没有灌注的肺组织会浮在液体表面不利于固定,切片以后也会看到很多的空泡)。

③蒸汽固定法:比较细小而薄的标本,可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。

(2)固定的目的

①保持其原有状态:使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质,迅速防止组织、细胞的死后变化,防止自溶与腐败,防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构,使之尽量保持生前的状态和结构。

②以便染色后易于鉴别和观察:不同组织成分对染料有不同的亲和力,以便染色后易于鉴别和观察。

③使组织块硬化,便于制作薄片(组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏)。

(3)固定液

固定液种类:一类是单纯固定液,即只有一种试剂;另一类是混合固定液,由两种或两种以上试剂组成。

作为较好的固定液,应有下列特性,首先,有强渗透力,能迅速的渗入组织内部;其次,不使组织过度收缩或膨胀,并能使组织内欲观察的成分得以凝固为不溶性物质;最后,能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。

固定液通常使用10%的甲醛溶液。特殊要求的组织,常需要特殊的固定液,取样之前应做好准备。如眼球样本应使用FAS眼球固定液,脂肪组织应使用脂肪组织专用固定液等。此外,在进行骨组织样本制备的时候,还应注意提前进行脱钙处理,可根据具体情况选择慢脱钙或快脱钙处理。

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总的来说,样品的采集是实验中至关重要的一环,如果取样环节出现了偏差,往往会导致后续检测结果的偏移,稍有不慎便前功尽弃。而清晰把握了不同检测实验的检测对象,并根据其特性采取不同的采样策略,搭配各种辅助工具及试剂,往往能够事半功倍,轻松完成实验。

最后,在采样过程中,应据实验动物福利伦理,在实验过程中尽量减少动物的痛苦,尽最大努力善待它们。


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