科研星球

细胞凋亡与坏死有何不同?

很多实验小伙伴表示不知如何区分细胞凋亡和坏死,其实细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。


概念


细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主性、有序性的死亡,他涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用,具有生理性和选择性的。


生理学意义


细胞凋亡对胚胎发育及形态发生、组织内细胞群的稳定、机体的防疫和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤和老化、肿瘤的发生进展起着重要作用,并且有着潜在的治疗意义。


概念


细胞坏死是极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡,是非正常死亡。


长期以来细胞坏死被认为是因病理而产生的被动死亡,但是近期的研究表明,细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式,具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时,坏死作为凋亡的“替补”方式被采用。


640.jpg


细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍常用的形态学检测方法。


光学显微镜和倒置显微镜

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。

本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察,作为分析指标之一。

未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,全面皱缩,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

染色细胞:姬姆萨(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常细胞核色泽均一;凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;坏死细胞染色浅或没染上颜色。  

苏木素-伊红(HE)染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞),正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。

0.png

荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342, Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。 

PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但PI不能通过正常细胞膜,Hoechst则为膜通透性荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 

凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

0 (1).png

电子显微镜

虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。

检测方法:透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,丙酮脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸电子又重染色,透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,乙醇逐级脱水,CO2临界点干燥,真空喷金,扫描电镜观察。

结果评判: 可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

缺点

1)只能定性,不能定量;

2)标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;

3)在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。

0 (2).png

流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射,分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标,细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此,只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解,导致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,细胞荧光染色后作流式细胞仪分析,可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰(xub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡细胞。

细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。


QQ客服
电子邮箱
淘宝官店
没有账号?