说起引物，做科研的同学并不陌生，应用也很广泛，比如：PCR、实时定量PCR、扩增基因片段等在整个circRNA载体构建过程中，引物占有十分很重要的地位。鉴于circRNA的特殊环状结构，其引物设计与常规线性基因差异较大，PCR的特异性要求与靶DNA特异结合，不与其他非目的的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能与引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。今天给大家介绍circRNA不同引物设计的方法，并附超详细工具实操，让你轻松学会！
PartⅠ利用circBase数据库进行circRNA引物设计
1. circRNA全长调取
首先根据circRNA的ID号找到全长序列，以hsa_circ_0016823为例，打开circBase网站：http://www.circbase.org/,输入ID后搜索，得到如下界面：
2. 针对上述序列，即可设计circRNA的全长序列调取引物，设计方法与常规基因引物设计不完全一致
（一）背靠背原则设计引物（Divergent primers）:
一般设计成背靠背，使环化位点包含在产物中间，除了需要将序列首尾拼凑成环化的形式外，和普通的引物设计基本一样的思路。设计出来大概是这样的：
对于多个外显子构成的circRNA情况：
因为circRNA的反向剪切有高度的可变性，可能是exon4单独成环，可能是exon4/5成环，也可能是exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6成环，包含exon4的circRNA有多个，此时按上面的方法设计引物，引物实际上可以同时扩增到exon4/5、exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6等成环产物，那么引物的特异性就没办法保证了，PCR产物电泳检测很可能是多条带，所以就需要第二种引物了。
（二）跨接点原则设计引物（Sjod Primers）:
设计出来大概是这样的：
以上两种引物设计好后也应先用样品扩增验证一下，并最好对PCR产物进行sanger测序，以确认扩增产物是正确的。检测circRNA过表达是否成功，需要同时用到普通的Divergent Primers和Sjod Primers两对引物，其中1）普通的Divergent Primers扩增产物在过表达组样品中应该是单一条带且大小正确，在NC中可能不是单一条带；2）Sjod Primers扩增产物在过表达样品和NC组都应该是单一条带且大小正确。具体步骤如下：
1. 同时用普通的Divergent Primers和Sjod Primers进行RT-qPCR，扩增曲线要正常，熔解曲线是单一峰，数据计算有过表达，一般50倍以上就是比较好的结果。无条件的也可以做半定量。
2. 分别对Divergent Primers和Sjod Primers的PCR产物做电泳检测，确认产物是单一条带，并且大小正确。
3. 过表达组样品使用Sjod Primers扩增的PCR产物进行sanger测序，以确认环化位点处是正确的。此时若有环化错误，在测序结果中是可以发现的。
PartⅡCircInteractome数据库设计circRNA的siRNA的靶标序列及Divergent primers
1. circRNA验证反向引物设计：
进入CircInteractome主页（https://circinteractome.nia.nih.gov/），选择Divergent primers search；输入circRNA分子后，点击Divergent primers search，即可获得所查询circRNA分子的junction sequence，下面还附带了2个PCR引物设计工具primer3和NCBI primer design.
实操如下：
siRNA干扰序列设计：
CircInteractome将会提供10个候选siRNA片段；随后可根据siRNA评分标准选择合适的siRNA片段。评分标准包括G/C含量30-60%，最后一个碱基为A/U等。
整体上，数据库使用和检索界面非常简洁方便，数据库操作起来还是很简单的！点一点就能解决circRNA引物设计，我就问你香不香！
参考文献：
Glažar P,Papavasileiou P, Rajewsky N. circBase: a database for circular RNAs.[J]. Rna-aPublication of the Rna Society, 2014, 20(11):1666-1670.
Dudekula D B,Panda A C, Grammatikakis I, et al. CircInteractome: A web tool for exploringcircular RNAs and their interacting proteins and microRNAs[J]. Rna Biology,2016, 13(1):34-42.
如果你的circRNA是由测序结果预测而得，就可以直接提取出它的剪切序列和基因组序列；如果circRNA已被研究存在于你要验证的物种中，可以从一些数据库或网站中找到它的序列。下面是几个常用的数据库和网站：
circBase，收集和整合已经发布的circRNA数据构建的数据库。网址：http://www.circbase.org/
circBank，整合已发布的人类circRNA的数据库。网址：http://www.circbank.cn/
circRNABase，整合已发表的circRNA数据，构建miRNA与circRNA以及circRNA与RNA结合蛋白（RBP)的互作网络。网址：http://starbase.sysu.edu.cn/mirCircRNA.php
deepBase，包含了大约15万的circRNA基因（人、鼠、果蝇、线虫等），构建了最全面的circRNA的表达图谱。网址：http://deepbase.sysu.edu.cn/
Circ2Traits，是一个收集与疾病或性状相关的circRNA数据库。网址：http://gyanxet-beta.com/circdb/
circNet，里面收录了一些circ-miRNA-gene网络，以及测序数据。网址：http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/
CSCD，癌特异环状RNA数据库 网址：http://gb.whu.edu.cn/CSCD/
circRNA特异性引物的设计
除了要遵循普通引物设计原则以外，circRNA引物设计还应满足以下原则：
对于外显子环化circRNA，引物跨剪切位点处（backsplice junction）设计；
对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点处设计，也可围绕内含子区域设计引物；
PCR扩增产物长度最好小于100bp。
首先，按照一般序列线性存储规则，默认按照5'→3'方向书写，为了便于进行引物设计，需先进行序列转换。截取3'端100-300bp长度序列置于5'端100-300bp长度序列前面形成一个新的序列。再拿这个新的序列在软件中按照常规方法设计引物，当然，还要确定引物的特异性，不断调试编辑上下游引物直到在NCBI中比对不到任何信息。
实例演示
以hsa_circ_0063162为例，具体步骤如下：
>hg19_hub_1_salzman_circRNAs range=chr22:36889680-36889850
5‘CTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTGTTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTT3’
01
序列转换
将3’端标注黄色序列移置序列5’端头部，转换后新序列如下：
TTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTTCTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTG
转换后新的序列中红色标注TGTTCTGC为circRNA剪接位点处，引物设计可按照常规PCR引物设计原理，跨改剪接位点处上下游进行设计，最终设计出引物必须包含剪接位点。
2
新序列粘贴（以primer 5.0为例）
打开primer 5.0软件，点击File/New/DNA sequence，如下图所示：
将新的序列粘贴到空白区，如下图所示：
3
开始设计
点击按钮进行引物设计，如下图：
4
参数设置
点击按钮进行参数设置，程序会自动设计引物，系统弹出下图对话框。请在以下对话框中修改参数，包括正反向引物结合模版起始终止位点以及PCR产物。以hsa_circ_0063162为例，剪接位点处于77-86之间，sense primer：1-50；Anti-sense primer：100-171；PCR Product：20-100 bp。
5
引物筛选
修改以上参数后，点击按钮，程序会弹出评分后的引物列表，如下图所示：
6
引物评估
对系统给出的引物根据评分大小进行筛选，一般根据系统评分高低进行筛选。选取评分第一的引物进行评估，如下图：
7
引物调整
使“Sense”中的“Tm”与“Anti-Sense”中的“Tm”差值的绝对值不大于2.5，“GC%”=40%~70%；核对“Hairpin”，“Dimer”，“False Priming”，“Cross Dimer”，确保对PCR扩增没有影响。
8
引物输出
点击“Edit”/“Copy”，输出“Sense primer”及“Anti-sense primer”，引物序列信息如下：
Sense primer：5’CCACGATGTGATGGATGG 3’;
Anti-sense primer：5’GAACTGTTTGGACACCGATT 3’
9
引物特异性评估
将以上引物序列导入NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中，采用“Primer-Blast”工具进行引物特异性比对分析，如下图所示：
参数设置完成后，点击按钮，弹出以下对话框：
比对结果显示此引物可结合很多序列，这说明引物特异性不够，可再次调试引物直到比对不到任何信息。
这样，你的circRNA特异性引物就设计好了。
一、circRNA数据库
首先，想要设计引物，就要有序列，要找到序列，必须要用到数据库，下面给各位小伙伴分享几个circRNA的数据库或者网站：
1、circBase，收集和整合已经发布的circRNA数据构建的数据库。
网址：http://www.circbase.org/
2、circRNABase，整合已发表的circRNA数据，构建miRNA与circRNA以及circRNA与RNA结合蛋白（RBP)的互作网络。
网址：http://starbase.sysu.edu.cn/mirCircRNA.php
3、deepBase，包含了大约15万的circRNA基因（人、鼠、果蝇、线虫等），构建了最全面的circRNA的表达图谱。
网址：http://deepbase.sysu.edu.cn/
4、Circ2Traits，是一个收集与疾病或性状相关的circRNA数据库。
网址：http://gyanxet-beta.com/circdb/
5、circNet，里面收录了一些circ-miRNA-gene网络，以及测序数据。
网址：http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/
6、CSCD，癌特异环状RNA数据库。
网址：http://gb.whu.edu.cn/CSCD/
二、引物设计
1、circRNA信息查找
a、以circbase数据库为例，首先访问circbase数据库（http://www.circbase.org/），如下图所示：
b、在搜索框中输入circRNA ID号，如：hsa_circ_0000284，然后点击Search，搜索结果如下图所示：
c、点击“fasta”，显示下图界面，然后勾选spliced，点击Search，下载序列。
GTATGGCCTCACAAGTCTTGGTCTACCCACCATATGTTTATCAAACTCAGTCAAGTGCCTTTTGTAGTGTGAAGAAACTCAAAGTAGAGCCAAGCAGTTGTGTATTCCAGGAAAGAAACTATCCACGGACCTATGTGAATGGTAGAAACTTTGGAAATTCTCATCCTCCCACTAAGGGTAGTGCTTTTCAGACAAAGATACCATTTAATAGACCTCGAGGACACAACTTTTCATTGCAGACAAGTGCTGTTGTTTTGAAAAACACTGCAGGTGCTACAAAGGTCATAGCAGCTCAGGCACAGCAAGCTCACGTGCAGGCACCTCAGATTGGGGCGTGGCGAAACAGATTGCATTTCCTAGAAGGCCCCCAGCGATGTGGATTGAAGCGCAAGAGTGAGGAGTTGGATAATCATAGCAGCGCAATGCAGATTGTCGATGAATTGTCCATACTTCCTGCAATGTTGCAAACCAACATGGGAAATCCAGTGACAGTTGTGACAGCTACCACAGGATCAAAACAGAATTGTACCACTGGAGAAGGTGACTATCAGTTAGTACAGCATGAAGTCTTATGCTCCATGAAAAATACTTACGAAGTCCTTGATTTTCTTGGTCGAGGCACGTTTGGCCAGGTAGTTAAATGCTGGAAAAGAGGGACAAATGAAATTGTAGCAATCAAAATTTTGAAGAATCATCCTTCTTATGCCCGTCAAGGTCAAATAGAAGTGAGCATATTAGCAAGGCTCAGTACTGAAAATGCTGATGAATATAACTTTGTACGAGCTTATGAATGCTTTCAGCACCGTAACCATACTTGTTTAGTCTTTGAGATGCTGGAACAAAACTTGTATGACTTTCTGAAACAAAATAAATTTAGTCCCCTGCCACTAAAAGTGATTCGGCCCATTCTTCAACAAGTGGCCACTGCACTGAAAAAATTGAAAAGTCTTGGTTTAATTCATGCTGATCTCAAGCCAGAGAATATTATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCAGCCTTACAGGGTTAAAGTAATAGACTTTGGGTCGGCCAGTCATGTATCAAAGACTGTTTGTTCAACATATCTACAATCTCGGTACTACAG
2、circRNA引物设计
circRNA的引物设计有以下两种方法：
a、 背靠背引物
通常获取到的序列为从剪切位点（backsplice）处打开后的线性序列，因此，在设计引物前应先进行序列位置的变换，截取3´端100-200bp长度的序列置于5´端头部，形成了一个新的序列，新序列的连接处即为剪切位点处。circRNA引物设计的方法按照常规PCR引物设计的原理，跨环化位点设计，上下游引物分别在环化位点的左右两边，即最终的扩增产物必须包含环化位点，背靠背的引物设计原理图如下图所示：
hsa_circ_0000284-qPCR-F-1: TCGGCCAGTCATGTATCAAAG
hsa_circ_0000284-qPCR-R-1: CACACTACAAAAGGCACTTGAC
b、跨环化位点引物
设计跨环化位点的引物同样按照常规PCR引物设计的原理，但是，这种方法要求上游引物（如下图a）或者下游引物（如下图b）要设计在环化位点处。
图a：
hsa_circ_0000284-qPCR-F-2: ATCTACAATCTCGGTACTACAGGTATG
hsa_circ_0000284-qPCR-R-2: TACCATTCACATAGGTCCGTGG
图b：
hsa_circ_0000284-qPCR-F-3: CTCAAGCCAGAGAATATTATGTTGG
hsa_circ_0000284-qPCR-R-3: AGACTTGTGAGGCCATACCTGTAG
三、确定circRNA引物的特异性
无论是常规PCR还是circRNAPCR，引物的特异性都是很重要的。如何确定引物的特异性？很多小伙伴在设计完引物之后会用软件或者是网站来评估引物的特异性，但是，由于circRNA的结构特殊性，仅仅用软件或者网站来评估是不够的，还需要做qPCR实验来验证引物的特异性。确定circRNA引物的特异性主要有以下3步：
a、 溶解曲线
溶解曲线单峰，Tm值在正常范围之内
b、 电泳图
电泳条带单一，条带大小正确
c、 Sanger测序
测序结果单峰，环化位点正确
