科研星球

关于内参基因的选择

管家基因


最普通的内参是内源性参照基因,也就是管家基因。

管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因,高度保守并且在大多数情况下持续表达。其表达水平受环境因素影响较小,而且是在个体各个生长阶段的大多数,或几乎全部组织中持续表达,或变化很小,因此常存在于生物细胞核的常染色质中。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响,而不受其他机制调节。

管家基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序,可以监控采样,运输,核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种,不同生理状态下,不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液,咽拭子等样品,管家基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。 


内参基因的选择

1、不存在假基因,以免基因组DNA的扩增;

2、高度或中度表达,避免太高或太低的丰度;

3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中,表达量无明显差异;

4、表达水平与细胞周期、活化等无关;

5、不受外源性或内源性因素的影响。

管家基因

在选择管家基因作为内参时,首先要按不同类型的分子选择正确的内参。

a、检测mRNA时的内参

通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulin

GAPHD

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写,经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中,并且在细胞中含量丰富,占总蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列,在同种细胞或者组织中的蛋白表达量一般是恒定的。故长期以来该基因被广泛用作qPCR或Western blot中的内参基因。

0.png

beta-actin

β-Actin是PCR常用的内参,β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分,分布广泛。

0 (2).png

β-Actin内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于β-Actin的检测分子量大约在42kD,因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,虽然β-Actin是最合适的内参抗体之一,但是在某些条件下,一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是,在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。

tubulin

tubulin是球形分子,有两种类型:α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin),这两种微管蛋白具有相似的三维结构,能够紧密地结合成二聚体,作为微管组装的亚基。α亚基由450个氨基酸组成,β亚基是由455个氨基酸组成,它们的分子量约55 kDa。因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。

b、检测蛋白时的内参

0 (1).png

检测蛋白时,常用蛋白内参有GAPDH、β-Actin、β-tubulin。选择的内参要跟目标蛋白分子量差5KD以上,所以需要根据目标蛋白的分子量来进行内参的选择。

c、检测miRNA时的内参

snRNA和snoRNA长度与miRNA相近,200bp左右,在多种组织细胞中高表达,不涉及miRNA的调节途径,且与miRNA探针设计方法相同,所以snoRNA是很好的内参选择。

0 (3).png

常用内参

介绍一下常用的内参U6:U6是一类snRNA,它是由RNA聚合酶III转录。主要形成小核核糖核蛋白颗粒,定位与细胞核内,表达稳定。

0 (4).png

d、检测lncRNA时的内参

检测lncRNA时,内参选择和mRNA一样,可以选择GAPDH、beta-actin等。GAPDH虽然在很多细胞实验中都很稳定,但是因为它是个糖代谢相关酶,在很多糖代谢变化的实验中都会剧烈变化,比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些肿瘤细胞中。因此内参不是绝对的。同样,beta-actin也不是绝对的,如果涉及到细胞骨架重排,解聚,重组的实验,beta-actin一样不可靠。如果不确定,可以多选几个内参候选,找一个变化量小的。最后,18S rRNA也可以作为lncRNA检测时的内参。

当然其他的内参可以作为lncRNA检测的内参,如:RPL13A

0 (5).png

e、检测circRNA时的内参

检测circRNA时可以用18S rRNA作为内参。

0 (6).png

18S rRNA是一类核糖体RNA,所常用来进行生物分类的依据。由于18SrRNA在生物中的表达比较保守,所以目前也用来作为内参。

用18s RNA作为RT-PCR的内参,应该和β-actin是一个道理,半定量的目的是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量,内参的目的是去除一些系统误差。

但是不同的是18s是rRNA,没有A尾巴,理论上总RNA转录时不能用OligodT作反转录引物,用随机引物或6聚体引物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊!如果选β-actin就不存在这个问题,因为mRNA,有A尾巴。   


QQ客服
电子邮箱
淘宝官店
没有账号?