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什么是细胞消化(Cell Detachment)?

 我们在细胞培养时大部会以贴壁的形式生长(除了取自血、脾或骨髓的细胞),使用的完全培养基中的血清,含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子(层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质),能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上,并形成键结、贴壁伸展。也就是所谓的~细胞消化Cell Detachment。


机械消化法
  直接用液体吹打或用刮刀,施予外力让细胞与培养底物分离;适用于贴壁性弱的细胞传代,但相较于其它消化方法,这种外力无法量化控制,细胞分散效果差,且可能会造成大量细胞破损,使内容物释放到培养基,进而影响细胞传代状态。


 离子螯合法
  细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结,当然也包含各种黏附蛋白(例:整合素、钙黏着蛋白、桥粒等),螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下,抽离这些离子,使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用,让细胞较容易在施予外力时,脱离培养底物并促进细胞分散。
  0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂,在37℃作用效果最佳(消化较敏感的细胞可在4℃作用),适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。
  但EDTA无法用血清终止其反应,所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液(如:PBS)清洗离心,以免影响后续细胞贴盘效果。


酶消化法
  用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质,适用于消化贴壁性稍强的细胞。


上述实验方法中最常见的还是胰酶消化大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可,但是我们发现吸去胰蛋白酶后,残留的那些附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2分钟足够消化细胞(绝大部分1分钟不到)。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是先采用PBS润洗细胞吸去,胰酶润洗吸去,然后37度消化细胞。


什么程度算消化完全呢?


所谓消化并不是细胞全部分散分布形成单个圆形才算消化完好,一般我们肉眼观察贴壁细胞表层,只要能漂浮移动了,多半呈沙粒状漂浮移动,其实已经可以了。说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了,细胞之间的附着也已经消失了,细胞已经独立分布了(虽然没有呈现很广的离散分布)。这个时候应该停止消化,不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好,间隙很大,才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液,之后在贴壁的过程中仍然会聚集,这个是贴壁培养的细胞,尤其是肿瘤细胞的一个特性。
     细胞只要能从基质上脱离下来,这个时候即使是成片的(比如Calu-3细胞),吹打不超过20次后(一般10次即可),成小规模聚集(10个细胞左右),是正常的,不要试图再去延长消化时间。不要以为成片分布是自己没养好,这个视细胞而定。如果和标准形态不一致,那可能是自己没消化好导致的,但如果消化方法正确,仍然成片分布,甚至完全吹打成单细胞悬液,贴壁后仍然成片分布,这是细胞的特性,是因为贴壁过程中重新聚集了。
     如果遇到比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),就以colon cancer为例,比如HCT15, LS411和KM12,这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100 mm dish,一次最多加入500ul,就足够了。即使这样难消化的细胞,一般不超过5min,即可见细胞成片移动,就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候,比如tsDC细胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙状移动。
      针对消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间,掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强,配好后可分装成小管,一次用完,其余冻在-20℃,以保持酶活力。细胞生长到覆盖70~80%瓶底时消化较好,若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
     我们常规的细胞实验(增殖,凋亡,迁移,分化之类的),如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话(难消化细胞例外),受消化影响不是很大。但少数实验,比如病毒包装,对细胞代数,对细胞状态要求极高。这个时候,胰酶消化,就是润洗,都会对细胞包装病毒的能力有影响,传代次数一多,细胞包装能力就会逐渐下降(当然也有其它因素影响包装效率)。这个时候都不用胰酶消化,用一些盐溶液(不是EDTA液)即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性,来使得细胞脱离基质附着表面,但不切割任何蛋白。

绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可:


吸去胰酶后,残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞(绝大部分1min不到)。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去,胰酶润洗吸去,然后37℃消化。比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育。



消化的影响:


常规的细胞实验(增殖,凋亡,迁移,分化之类的),受消化影响不是很大,如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化(难消化细胞例外)即可。但少数实验,比如病毒包装,对细胞代数,对细胞状态要求极高。这个时候,胰酶消化,就是润洗,都会对细胞包装病毒的能力有影响,传代次数一多,细胞包装能力就会逐渐下降(当然也有其它因素影响包装效率)。这个时候都不用胰酶消化,用一些盐溶液(不是EDTA液)即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性,来使得细胞脱离基质附着表面,但不切割任何蛋白。


EDTA的作用:


许多人不用胰酶,只用EDTA,或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白,trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白,而EDTA通过螯合Ca离子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA,或者对付特别难消化的细胞,添加多一些EDTA,就是这个道理。一般不要试图延长消化时间(如果10min还消化不彻底的话),而应该想其它办法。


PBS洗涤注意事项


消化之前用PBS洗涤,是常见的操作,因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲,对于一些难消化细胞,那么可以配制不含Ca,Mg离子的PBS,因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞,不需要配制如此溶液。



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