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详细解读国自然热点的实验设计

对于大多数刚进实验室的同学,熟悉和常做的实验大概都是PCR和western blot,而较为复杂一些的实验可能尚未涉及。最近本人也刚刚进行泛素化相关的实验,那么,今天就跟大家一起学习下泛素化到底是什么,以及如何进行目标蛋白的泛素化水平检测。


首先的第一个问题:泛素化是什么?是一个什么样的过程?

泛素化,英文名:Ubiquitination,是指泛素在一系列酶的催化下对靶蛋白进行特异性修饰的过程,是蛋白质翻译后修饰的一个重要途径。简单说呢,就是细胞内的一种蛋白修饰机制,它会给不同的蛋白标记上不同的标签,接下来就是细胞内的一些酶和细胞器通过识别标签,来作用这些蛋白。如果大家还是觉得生涩难懂呢,本人在网上看过一个很nice的图来解释泛素化,就是拆迁房子,将拆这个字写在房子上。“房子”就是靶蛋白,而“拆”就是泛素。

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(图片来源网络)


还需要刚认识泛素化的小伙伴们了解的一个内容就是:泛素化和去泛素化是一个动态平衡,泛素是在E1E2E3三类酶依次催化下,特异性地连接到靶标蛋白,或靶标蛋白上已经被连接的泛素链上。因此,我们靶标蛋白被连接的泛素数量并不是固定的!




一、如何进行实验,前期准备有哪些


首先对泛素化检测较为基础的实验就是,对蛋白质泛素化水平的检测。那么需要确定的有几点内容:

1.选择的目的蛋白是否发生了泛素化。

2.发生泛素化的蛋白具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化。

关于这两个问题,建议大家不要忽略,尽量在实验前多做功课。这里推荐大家一个网站,PhosphositePlus数据库(链接:https://www.phosphosite.org/),可以查询蛋白质的翻译后修饰的相关内容,包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等,相关操作网上应有尽有,小伙伴们可以放心使用起来。

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(图片来源网络)




二、选择实验方法


相信很多小伙伴最开始进行泛素化实验的时候都查阅很多资料,本人也不例外。泛素化的检测方法有很多种,大多数情况下,主要是以下几种类型:

1.通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带,通过目的蛋白的抗体和特异泛素化抗体进行反应后,进行判断目的蛋白泛素化水平的检测。该方法是初检哪个蛋白发生了泛素化修饰。

2.通过免疫沉淀(IP)的方法,将某目的蛋白进行分离和收集,分析目的蛋白的修饰特性。之后可以选择例如WB实验,同时使用泛素化抗体进行检测。该方法可以明确目的蛋白的泛素化水平及是哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

3.在工具细胞内进行目的蛋白的转染,在细胞内高表达后,提取与特定的泛素化蛋白或肽段进行孵育,之后通过IP或WB进行分析检测。该方法更加明确目的蛋白泛素化位点。


这几种方法各有好坏,大家可以根据实验目的进行选择。

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(图片来源网络)




三、泛素化实验需要注意!!!


实验前期

1. 大多数情况下,泛素化检测需要使用到免疫沉淀技术(IP),那么选择一个优秀的试剂盒绝对是事倍功半。本人在实验开始时查询了一些相关文献,也看了很多帖子,大多数推荐的试剂盒都是abcamthermoinvitrigen。本人使用过的国产试剂盒,效果也很不错,大家可以根据经费,按需挑选。实验操作严格按照说明书进行即可,不太确定的推荐大家多询问技术支持,一定会给你最佳解决办法。

2. 对于泛素化检测,不能忽略的重要一点就是蛋白酶体抑制剂的使用。在常见文献中,大多数使用的都是MG132,也有少量使用lactacystin。这两种抑制剂的区别是lactacystin是抑制20S蛋白酶体,而MG132是抑制26S蛋白酶体。但通过实验本人发现,有些蛋白可能对某种抑制剂更加敏感,因此操作时我们需要多加探索和尝试。这里也建议小伙伴们,IP实验前,通过预实验确定抑制剂的使用剂量和作用时间,选择最佳方案进行实验,以免费时费力。


实验操作

1.对于IP实验,为了防止蛋白的降解和提取不充分,除特别说明外,所有操作步骤在冰上完成!

2.未获得靶蛋白主要考虑:可以增加细胞或者组织裂解物的浓度;增加裂解物中总蛋白的含量;更换新的蛋白酶抑制剂。

3.抗体的使用:IP实验中一定要提前计算好抗体的使用量,有疑问的建议实验前咨询过技术,抗体的使用量可以适当提高一点。


实验结果

关于泛素化的结果,有时也是让人很confuse的一个问题。本人刚开始学习查了很多丁香园大佬的讲解,有一些内容可以和小伙伴们一起分享一下。

1.首先要通过IgG组,去除轻重链影响,和验证是否有非特异性结合。这也是帮我们分析结果的一个重要手段。

2.一个泛素分子量大小是8.5kDa,蛋白质上可以发生单泛素修饰,多泛素修饰和多聚泛素化修饰。因此检测泛素化时,当使用的泛素抗体没有特异性,只要目的蛋白上面连接泛素化多肽,就会在膜上产生条带,因此我们观察到的是多信号条带,即有拖尾的现象。当然也可以使用K48或K63多聚泛素化链。

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(图片来源网络)





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