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基于双抗作用机制的生物测定方法

细胞桥接

细胞桥接双特异性抗体(Bispecific antibodies,BsAbs)结合两个不同细胞的表面抗原,一个在效应细胞表面,另一个在靶细胞/肿瘤细胞表面,导致下游信号网络的激活和靶细胞的杀伤。

目前依旧最热的研究管线是T细胞依赖性BsAbs(T-cell dependent BsAb,TDBs),包括一个CD3抗体臂和一个靶细胞表面的肿瘤特异性抗原抗体臂。也有一些BSAbs通过结合其他表位,如CD5或CD28等共刺激受体来激活T细胞。BsAbs对靶细胞和T细胞的连接导致免疫突触的形成,诱导T细胞激活,并导致穿孔裂解靶细胞的酶和颗粒的释放。

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TDBs作用机制(Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5350)

TDBs利用患者自身的免疫系统,无需MHC-复合物的激活,不依赖于TCR表位特异性来杀伤肿瘤细胞。虽然TDBs通常比标准的单克隆抗体药物更复杂、生产和表征更困难,但它们目前比CAR-T治疗更便宜,后者必须为每个患者单独生产。此外,与CAR-T疗法相比,TDBs可以具有更有利的安全性,其不良事件越少,如全身细胞因子释放综合征(这是与免疫疗法相关的最常见不良事件)。

除了TDBs之外,还有一些双特异性抗体,通过同时结合CD16(FcγaRIII)和肿瘤特异性抗原来招募和激活NK细胞;通过靶向CD89来招募和激活巨噬细胞。。

生物测定方法

1.结合实验:任何基于抗体技术的药物,结合实验都是基础。通常使用ELISA法和SPR法。检测双特异性抗体和相应抗原的结合能力。

2.生物活性测定:桥接法双特异性抗体,其主要活力是效应细胞和靶细胞形成免疫突触,进而活化,杀伤靶细胞。因而报告基因法检测效应细胞激活,以及细胞杀伤实验检测靶细胞的杀伤效果,是主要生物活性测定实验。

3.其他功能测定:通过流式细胞术检测细胞清除,细胞因子释放,或者细胞表面marker变化

4.效应功能:主要检测ADCC和ADCP。

配体-受体阻断或激活

这类双特异性抗体,具有靶向多个受体的能力,在特定的细胞环境下靶向和激活一个受体,尤其是单独一个抗体无法特异性激活的受体。如抗成纤维细胞生长因子受体(aFGFRI)/抗Klotho(aKLB)BsAb激活FGFRI/KLB受体复合体,导致体重减轻和减少临床前模型中与肥胖相关的疾病。

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FGFR1受体(J. Clin. Invest. 115, 1627–1635)

通过选择性地靶向FGFRI/KLB,该分子在与KLB结合时激活FGFRI,从而避免广泛的FGFRI激活(FGFRI受体在组织中广泛的表达),减少单克隆抗体FGFRI激动剂相关的副作用。

除了作为受体激动剂外,BsAbs还可以是有效的受体拮抗剂。对于HER-2(曲妥珠单抗)治疗耐药的患者,HER2双抗是一个好的选择。HER2XCD3双抗可以通过桥接T细胞进行细胞杀伤,HER2XHER3双抗则阻止配体激活HER3,并抑制HER2高表达肿瘤中的PI3K信号,从而克服肿瘤对于HER2单抗的耐药。

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HER2单抗和双抗作用机制(Exp. Hematol. Oncol. 2017, 6, 31.)

BsAb有时与mAb的联合治疗的目的相同,但在某些情况下,BsAb提供了一种特殊的优势。经典的案例是PD-1XCTLA4双抗(如下图MEDI5752),通过优先抑制PD1+细胞上的CTLA-4,导致与免疫激活相关的不良事件比传统联合治疗更少。单价CTLA-4抗体臂对CTLA-4的抑制降低,但是不影响PD-1抗体臂对于PD-1的抑制。因此,BsAb能够在PD1+细胞上饱和CTLA-4受体,而不广泛抑制CTLA-4,从而导致更少的不良事件。使用该BsAb对CTLA-4和PD1的双特异性靶向也会导致PD1的内化和降解,这是通过CTLA-4和PD1mAbs的组合没有观察到的效果。

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MEDI5752作用机制(Cancer Discov. 2021.)

生物测定方法

1.结合实验:使用ELISA和SPR法进行单靶点和双靶点的结合实验,检测双特异性抗体和抗原的结合能力等。

2.生物活性:受体激活或阻断后的细胞活性变化,如增殖,凋亡,细胞因子释放等。

3.其他功能研究:如激活或阻断受体后,下游激酶活性改变,钙流变化等

4.效应功能:CDC、ADCC、ADCP、FcγR结合等

辅助因子模拟

Emicizumab (marketed name Hemlibra®),是一种用于治疗A型血友病的BsAb。BsAb与凝血因子X和IX结合,因此能够发挥凝血因子XIII的作用(在许多血友病A患者中缺少的凝血因子)。

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Emicizumab 作用机制(Thromb. Haemost. 2017, 117, 1348–1357)

生物测定方法

1.结合实验:使用ELISA和SPR法进行单靶点和双靶点的结合实验

2.生物活性:FXa活性

3.其他功能研究:凝血酶生成分析

归巢双抗

归巢BsAbs的一个抗体臂负责将分子带到很难抵达的位置。比如一些BsAbs已经被开发出来,能够通过靶向转移酶受体(transferase receptor,TFR)来跨越血脑屏障,一旦穿过屏障,非转移酶受体臂就可以靶向感兴趣的治疗靶点(比如淀粉样蛋白和其他阿尔茨海默病靶点 BACE1)。

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TfR-BACE1双抗结构示意图(Sci. Transl. Med. 2014, 6, 261ra154.)

此外,还有串联scFv 的BsAb的例子,它针对激活的血小板和SCA-1,帮助将干细胞带到损伤的位置;它正在探索用于治疗心肌梗死。

生物测定方法

1.结合实验:BLI及竞争法ELISA。

2生物活性:归巢抗体之外分子的生物活性。

3.其他功能研究:荧光示踪检测双特异性抗体在体内和细胞内分布等 。

总结

双抗或者多特异性抗体的多重作用机制,是克服肿瘤耐药,丰富肿瘤治疗策略重要途径。但双抗的多重作用如何测定,才能充分验证其作用机制及表征有效性,也是双抗开发的难点。

参考文献

1.Kharitonenkov, A, et al, (2005) FGF-21 as a novel metabolic regulator. J. Clin. Invest. 115, 1627–1635
2.Dovedi, S.J.; Elder, M.J.; Yang, C.; Sitnikova, S.I.; Irving, L.; Hansen, A.; Hair, J.; Jones, D.C.; Hasani, S.; Wang, B.; et al. Design and efficacy of a monovalent bispecific PD-1/CTLA-4 antibody that enhances CTLA-4 blockade on PD-1+ activated T cells. Cancer Discov. 2021.
3.Kitazawa, T.; Esaki, K.; Tachibana, T.; Ishii, S.; Soeda, T.; Muto, A.; Kawabe, Y.; Igawa, T.; Tsunoda, H.; Nogami, K.; et al. Factor VIIIa-mimetic cofactor activity of a bispecific antibody to factors IX/IXa and X/Xa, emicizumab, depends on its ability to bridge the antigens. Thromb. Haemost. 2017, 117, 1348–1357
4.Yu, Y.J.; Atwal, J.K.; Zhang, Y.; Tong, R.K.; Wildsmith, K.R.; Tan, C.; Bien-Ly, N.; Hersom, M.; Maloney, J.A.; Meilandt, W.J.; et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci. Transl. Med. 2014, 6, 261ra154.
5.Yu, S.; Liu, Q.; Han, X.; Qin, S.; Zhao, W.; Li, A.; Wu, K. Development and clinical application of anti-HER2 monoclonal and bispecific antibodies for cancer treatment. Exp. Hematol. Oncol. 2017, 6, 31.


转自:佰傲谷

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