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质粒构建从入门到精通

今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记


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质粒构建的原理


外源 DNA 经 PCR 扩增后,用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段,DNA 连接酶将二者进行连接,然后转入宿主细菌,通过筛选鉴定获得重组克隆。经过一系列的操作,「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。

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质粒构建流程示意图




质粒构建的步骤


「快递」目标片段的过程主要有三个步骤:
▼▼▼
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01



PCR 扩增


「快递」准备,首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应,它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅扩增,在克隆前获得大量的目标基因片段。

PCR 扩增

简要步骤:

利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后,配制 PCR 反应体系:将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入,加好后轻微点离,放入 PCR 仪中扩增目的片段,扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。


Tips

▼ 扩增过程中的关键点 ▼

Q

PCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带(大小不对)的现象。



A:通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量,提高退火温度,可以提高扩增特异性。此外引物设计的好坏是关键。除了按照常规引物设计规则外,构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。


常规引物设计原则

  1. 引物长度:18-30bp,常用 20-22bp 左右。

  2. 引物 Tm 值最好在 60℃ 左右,两条引物间 Tm 值要保持接近,最好不超过 5°C。

  3. GC 含量 40%-60%,45-55% 为佳。

  4. 引物自身不应有连续 4 个及以上碱基的互补,避免形成发卡结构。

  5. 引物之间不应有连续 4 个及以上碱基的互补,避免形成引物二聚体。

  6. 3' 端避免连续碱基的重复,如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。

  7. 3' 端最后一个碱基最好是 G 或 C。

  8. 可使用 NCBI primer-blast 比对引物特异性。


一般在引物的 5′ 端添加酶切位点时(不影响扩增的特异性),根据酶切位点序列,需要添加不同种类和数量的保护碱基,多加 3 个碱基可以满足几乎所有限制性酶切要求,如常用 BamHI(CGCGGATCCGCG,其保护碱基为蓝色部分。上下游引物最好加入不同的酶切位点,避免片段在连接过程中倒置,影响基因序列的正常表达。



Q

扩增的片段拖尾严重,产物在凝胶上出现弥散状态。

A:原因可能在于模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等。注意操作轻柔,PCR 扩增体系各组分严格参照说明书加入。


Q

片段太长难扩增、发生错配概率大、测序出现点突变?



A:扩增中设置适宜的退火温度(60℃ 左右),循环次数(30 次左右)不要太多,酶量要适中。传统 Taq 酶便宜高效,但扩增长度有限,出错率高。针对少量模板、复杂模板、长片段、稳定性差模板、高 GC 含量模板的扩增,选取具有高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶是解决问题的重要一环




02



酶切酶连


获得目标片段后,要交到「快递员」手中,必须借助两个工具来实现——酶切工具(限制性内切酶)连接工具(DNA 连接酶)。

酶切酶连

简要步骤:

配制琼脂糖凝胶(常用浓度 1-2%)后点样,切胶电泳回收目的片段,选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割,酶切后的片段再次电泳回收,测定浓度后按比例加入 T4 DNA 连接酶,粘性末端载体、目的片段、缓冲液,进行连接后直接转化。


Tips

▼ 酶切酶连技术关键点 ▼

Q

实验中遇到双酶切,经常会出现分开酶切费时费力(步骤繁琐),酶切时间长,产生星活性等问题;而双酶切也有可能(缓冲体系和最佳温度不同)产生酶切不完全现象。

A:选取可保证两种酶活性的缓冲液是关键,既保证酶切效率又可以避免酶切过久。加样五分钟,酶切两小时甚至过夜,漫长的等待总让人焦躁不安。


转化鉴定


「快递」已打包,「快递员」已就位,如何让包裹高质高效的送达?这就不得不借助快速转运工具——感受态细胞

常见的感受态细胞非 TOP10、DH5α、BL21 莫属了,他们可是转运过程的小能手,负责质粒的克隆和表达。

转化鉴定

转化及鉴定简要步骤

将连接产物加入感受态细胞,冰上放置30min、42°C 热激转化或电转化,加入无抗性 LB 培养基,200rpm -37°C 摇床摇 45-60min 后,涂至抗性或者其他筛选平板上,37°C 培养过夜、挑取 3-5 单个克隆摇菌、菌落 PCR 或提取质粒后酶切鉴定、鉴定完毕后送质粒或菌液测序验证。


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转化鉴定简易流程

Tips

▼ 转化及鉴定小贴士 ▼

Q

转化后克隆数量少?


A:对于初学者,设置阴性和阳性对照很有必要。克隆过程中,阴性对照-空载长出菌落,判定可能是酶切不完全导致,阳性对照不出斑,转化实验的操作可能出现问题。感受态细胞切勿反复冻融,且热激时间很重要,一定要精准到秒,同时正确使用抗生素或其他筛选标记。


Q

菌落太多但假阳性率高,总是挑不到正确的克隆。


A:PCR 鉴定正确后测序却不对,假阳性克隆太多,选择行之有效的鉴定方法有小妙招。菌落 PCR 鉴定引物需跨区域设计,一条引物设计在载体上,另外一条在目标片段上,即可避免假阳性克隆又筛除反向插入片段,此外还可以通过提取质粒酶切跑胶进一步排除错误克隆。



质粒构建,实验看似简单却总会出现各种问题,上面总结的隐藏技能,希望能帮助大家顺利完成实验。



读懂质粒:

拷贝数

对于质粒载体,拷贝数是我们最关心的特性之一。实际上,每个细菌中的质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质,可以把质粒分为两类:

严紧型质粒:当细菌染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细菌内只含1~2个质粒;

松弛型质粒:当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。这些质粒的复制是在寄主的松弛控制之下的,每个细菌中含有10-200份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还可使质粒拷贝数增至几千份。

当然,恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、质粒的大小及培养条件有关。

那么到这里你可能会问,高拷贝质粒我们可以多提一点质粒,低拷贝数的质粒有什么作用呢?确实,低拷贝数的质粒用途不是十分广阔,主要用于以下两点:

  1. 高拷贝数的质粒往往不稳定,进行大片段克隆或者带有毒性DNA克隆时会用低拷贝;

  2. 质粒的扩增会占用大量资源,当载体用于表达或者其他用途时,也会使用上低拷贝质粒。

质粒的接合转移与穿梭质粒

质粒的接合转移是细菌遗传物质转移的一个重要方式。在质粒转移过程中,供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触,质粒从供体细胞向受体转移,同时进行质粒复制。按能否自主转移,可以将天然存在的质粒分为转移型质粒和非转移型质粒两大类。

这里要注意的是,获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性,如耐药性或产生细菌素的能力等。从环境友好出发,实验室里的废弃菌液,一定要灭过菌才能倒哦。

穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和筛选,因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间,也可以推广到真核生物表达载体的构建,如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增,也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。

质粒的不相容性

通俗来说,就是一山不能容二虎。但是作为科学来说,我们需要一个严谨的定义。

“利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争,这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处,这种现象称之为不相容性”。

那要怎么才能在一个菌里面使用两个质粒呢?简单的方法就是使用不同复制源的且带有不同抗性基因的两个质粒。

如何读懂一个质粒

如何读懂一个质粒,我们以下图慢病毒质粒为例说明:

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质粒图谱由吉满生物提供

  1.  pUC ori:复制起始点,pUC为高拷贝表达质粒(120-200个/细胞)。

  2. Amp:氨苄抗性,为原核抗性,用于质粒抽提时的筛选。

  3. U6 promoter:U6启动子,真核启动子,启动shRNA的表达。

  4. CMV:真核启动子,启动ZsGreen1的表达。

  5. ZsGreen1:第三代绿色荧光蛋白,亮度最高的的荧光蛋白。

  6. PGK真核启动子,启动Puro的表达。

  7. Puro:嘌呤霉素抗性基因,真核抗性,用于质粒或病毒进入细胞后的筛选。

  8. Amp:氨苄抗性基因,原核抗性,用于质粒抽提时的筛选。

  9. WPRE:转录后调控序列,增加外源片段的表达效率。

  10. 3’LTR、5 LTR:逆转录病毒基因组两端各有一个长末端重复序列(5 —LTR和3 —LTR),不编码蛋白质,含有启动子,增强子等调控元件。

质粒图谱哪里去找?

方法一:使用 Vector NTI 软件

这款软件的软件包里包括常见和经典的质粒图谱。要想对质粒图谱了解更直观,安装这款软件是非常必要的。

方法二:查找质粒图谱的网站

Addgene
地址:http://www.addgene.org/

Vector DB

网址:http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html

此网站页面比较简陋,但分类比较直观,总结和分类都比较完整。基本包括了所有表达系统的质粒信息。

NCBI

网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

这个名气太大就不介绍了。

Google 及 Google 学术

检索式:质粒名 + map
质粒名 +sequence +filetype:txt or filetype:pdf
或者:进入 google,点击「图片搜索」,直接查找图谱。

其他的一些核酸数据库

欧洲分子生物学实验EMBL:http://www.ebi.ac.uk/

方法三:如何查找改造过的质粒的质粒图

有些质粒是经过改造的,所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时,可以在 google scholar 中输入质粒名称,可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒,从而可了解到质粒的来源或者籍此向作者咨询或索取。



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