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基因沉默(RNAi)及siRNA设计大全

RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导目标基因的沉默,能够迅速阻断基因活性。


RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。


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 常用的RNAi的研究策略



一、直接合成针对靶基因的siRNA 。(合成的是RNA,不是DNA)

通过转染(有用于siRNA转染的试剂)的方法使之进入细胞内,参与到RNAi途径,发挥使靶基因沉默的效应。这一方法受转染效率的影响较大,而且能顺利的进入RNAi途径的效率怎么样,还有待验证。不过目前有不少基因的siRNA已经有商业产品,所以使用时买来就可以了,比较方便。

而且直接合成的siRNA可以进行小分子多肽等配体标记,可进行体内研究,注入体内后,通过配体的识别,被特定的细胞吸收,在特定的靶细胞内实现RNAi研究。


二、构建shRNA的质粒表达载体。

shRNA质粒转染细胞,在细胞内转录生成shRNA,利用细胞内的Dicer酶,生成相应的siRNA,发挥RNAi作用。


三、构建shRNA的病毒表达载体。

常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等,机制与质粒载体相似,利用了病毒感染细胞效率比较高的特点,解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。




siRNA寡聚核苷酸设计原则:


1. siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。

并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样,设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则,而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高,3个保证中2个。

2. siRNA的反义链3'端最好以UU结尾,这被公认是最有效的的siRNA结构。

现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi,你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA,要避免以G结尾,因为后继处理时RNase会切除末端的G。

3. 多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。

没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果,分散分布可以减少风险。

4. 避开和其他基因同源序列,以免“误伤群众”。

潜在的目标序列都到NCBI BLAST一下,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,和其他基因有碱基同源的序列一定枪毙掉。

5. GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。

有较多选择时留意,不要有连续3个以上的GC,也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章,由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上,究竟哪条链取决于RNA解旋酶,而正义链5'端以GC开头,且5'端1-4个碱基GC含量高,且16-19位碱基GC含量低的序列,得到的siRNA反义链5'端GC含量低,3'GC含量高(也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU),使得反义链比较容易正确结合RISC,因而基因沉默效果比较好。

如果是shRNA表达载体,用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6,最适合的结构是5’GN,后面连续4个U结尾即可令转录终止,要避免序列中G,减出现连续的U/A。

6. 一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs,平行实验以期提高成功率。

据评估,随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达(减少75%-95%以上的mRNA),一半以上的几率能达到50%的沉默效果。




 siRNA设计工具


研究人员自建的设计工具,以及一些公开的siRNA信息数据库,仅供参考。

  1. Whitehead Institute开发的工具(可以自定义你认为有用的计算法则,删除你认为不需要的法则,而且会不断检索最新的法则并添加进去):http://jura.wi.mit.edu/siRNAext

  2. siSearch (可以给设计结果评分):http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html

  3. sFold:http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl

  4. RNAi Codex:http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl

  5. siRNA User Guide (by Tom Tuschl):http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html

  6. shRNA Designer:http://shRNAdesigner.med.unc.edu



商家免费工具:

1. Ambion公司:http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

2. Dharmacon公司siRNA设计:http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx

3. Dharmacon公司Seed Locator:http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx

4. Promega公司:http://www.promega.com/siRNADesigner/

5. Invitrogen公司:https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/

6. Genelink公司:http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp




化学合成siRNA


目前化学合成的siRNA主要有:普通siRNA、化学修饰siRNA和荧光标记siRNA。

化学修饰siRNA:可以增强siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性,同时与普通的siRNA相比,延长了作用时间。

荧光标记siRNA:在化学合成siRNA时,可以对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到,确定转染效率,优化转染条件;标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。


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