基础研究模板：间充质干细胞-外泌体-巨噬细胞-焦亡_生物研究_实用技巧

外泌体作为细胞分泌至胞外的小囊泡，通过其内携带的生物活性物质参与细胞间信息交流与物质运输，对靶细胞的炎症反应和免疫功能发挥调节作用。人诱导多能间充质干细胞（human-induced pluripotent mesenchymal stem cell，iMSC）是体细胞经过转化因子重编程得到的具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞，因自体来源丰富、体外扩增能力强，成为获取大量外泌体的来源干细胞，已在免疫、组织修复等各大领域被广泛研究，但是目前关于 iMSC 来源外泌体（exosomes derived from iMSC，iMSC-Exos）对急性肺损伤（acute lung injury，ALI）炎症反应的作用报道较少。研究表明，肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）焦亡能引起 ALI］，且脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）联合三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是诱导细胞焦亡的经典激活剂。本研究将 iMSC-Exos 应用于 LPS 联合ATP 诱导的 AM 焦亡模型，观察细胞焦亡相关指标的变化，进一步探讨 iMSC-Exos对 AM焦亡的作用机制，为治疗 ALI 引起的过度炎症反应提供新的策略及理论基础。

细胞来源：大鼠 AM 细胞株 NR8383 购自中国科学院细胞库；iMSC 由上海交通大学附属第六人民医院骨科研究所汪泱教授惠赠。

细胞培养：NR8383 细胞培养于含 15% 胎牛血清的 F-12K 培养基中，并置于 37 ℃、5% CO2 恒温细胞培养箱培养，2～3 d 更换 1 次培养液，3～4 d 传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。

外泌体提取：采用旋转超滤法提取外泌体。收集 iMSC 细胞培养上清液，离心去除残留细胞及细胞碎片，过滤后加入 Model 8050 型旋转超滤仪，超滤完毕后加入 50 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）并再次超滤，重复 3 次。超滤结束后，将超滤膜上的外泌体用 0.5 mL PBS 溶解混匀，再转移至 1.5 mL 离心管中，-80 ℃冰箱中保存备用。

外泌体鉴定

蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测外泌体标志性蛋白表达：提取外泌体，蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜、封闭；依次加入抗 CD63、CD9 一抗（均 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后加入相应二抗，室温孵育 1 h；洗膜后加入增强化学发光试剂，采用曝光机成像并拍照。

透射电镜下观察外泌体的形态：吸取充分混匀的提取物 20 μL 滴到孔径 2 mm 的载样铜网上，室温静置 5 min，滴加醋酸双氧铀复染 2 min，室温下晾干；将样品置于透射电镜下成像并拍照。

外泌体直径检测：用 PBS 稀释样品，向样品板中加入 100 μL 稀释液，应用 iZON 颗粒分析仪，采用高分辨率可调电阻脉冲检测样品颗粒直径。

外泌体荧光标记：将 PBS 重悬的外泌体稀释后加入 4 μL PKH-67 染色液，室温下孵育 5 min；加入0.1% 胎牛血清 2 mL 终止染色；转移到外泌体旋转柱中，4 ℃离心 2 min；收集 PKH-67 标记的外泌体与 AM 共孵育 24 h，并采用 4'，6- 二脒基-2- 苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）标记细胞核，于荧光显微镜下观察 AM 摄取外泌体的情况并拍照。

实验分组

实验分组及处理：将细胞分为 3 组。LPS/ATP组细胞经 500 μg/L 的 LPS 刺激 23 h 后加入 5 mmol/L ATP刺激1 h诱导细胞焦亡；iMSC-Exos组用100 mg/L（蛋白定量）iMSC-Exos 预处理 AM 3 h 后再予以 LPS和 ATP 刺激；对照组在细胞上清液中加等量 PBS。24 h 后收集细胞及细胞上清液，进行后续实验检测。

监测指标

细胞活性实验

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测

Western blotting 检测 NLRP3 炎症小体途径及焦亡相关蛋白消皮素D （gasdermin D，GSDMD）表达

细胞培养上清液中白细胞介素（interleukins，IL-1β、IL-18）测定

细胞凋亡检测

免疫荧光法检测细胞 caspase-1 的表达

结果：外泌体的鉴定

iMSC-Exos 的鉴定：透射电镜下观察（图 1A），外泌体结构完整，呈圆形囊泡状。Western blotting 显示（图 1B），外泌体特异性生物标志物 CD63、CD9 在iMSC-Exos 中呈阳性表达，但不表达 GAPDH。高分辨率可调电阻脉冲检测显示，粒子直径众数 90 nm，平均直径 130 nm，提示成功提取到 iMSC-Exos。

AM 对 iMSC-Exos 的摄取（图 2）：荧光显微镜下显示，将 PKH-67 标记的 iMSC-Exos 与 AM 共培养24 h 后，iMSC-Exos 被 AM 摄取并转移到细胞质中，提示 iMSC-Exos 能够被 AM 吞噬。

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公告一

iMSC-Exos 对 AM 焦亡毒活性的影响（表 1）：在使用 LPS 和 ATP 刺激后，AM 活性较对照组显著下降，而坏死物质 LDH 的释放量较对照组显著增加（均P＜0.01）。给予 iMSC-Exos预处理后，与 LPS/ATP组相比，iMSC-Exos 组 AM 活性显著升高，LDH 活性显著下降（均 P＜0.01）。提示 iMSC-Exos 能增强 AM活性，减少细胞坏死。

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iMSC-Exos 对 AM 焦亡炎症反应的影响（图 3）：给予 LPS和 ATP刺激后，细胞上清液中 IL-1β、IL-18水平较对照组显著升高（均 P＜0.01）；与 LPS/ATP组相比，iMSC-Exos 预处理后，AM 分泌 IL-1β、IL-18水平显著下降（均 P＜0.01），提示 iMSC-Exos 能逆转AM 焦亡后释放的炎性因子水平。

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iMSC-Exos 对 AM 焦亡的作用机制（图 4～6）：经 LPS 和 ATP 刺激后，AM 凋亡率及 caspase-1 表达均较对照组明显增加（均 P＜0.01）；经 iMSC-Exos 预处理后，细胞凋亡率及 caspase-1 表达较 LPS/ATP 组显著下降（均 P＜0.01）。此外，LPS/ATP 组 NLRP3、cleaved caspase-1 及 GSDMD 的蛋白表达水平均较对照组显著升高（均 P＜0.01）；与 LPS/ATP 组相比，经iMSC-Exos 预处理后，NLRP3、cleaved caspase-1 及GSDMD 的蛋白表达水平均显著下降（均 P＜0.01）。表明 iMSC-Exos 可能经 NLRP3 炎症小体途径抑制AM 焦亡。