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qPCR常见问题及解决方案

在RT-qPCR的实验过程中,大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。小翊给大家整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案,以供大家参考。



Part 1 扩增曲线异常


正常的扩增曲线一般呈S型,Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。


1.Ct值偏大(如Ct值>30)
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1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标准曲线确认扩增效率。
3)扩增产物过长,建议用三步法程序扩增或优化引物,扩增产物长度最好不超过300bp。
4)体系中可能存在抑制剂影响酶的活性,建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。


2.扩增曲线无法达到平台期
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基因丰度低、循环数较少,建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。


3. 扩增曲线平台期下降
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可能是基线范围设置不当,这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值(一般建议设置为Ct值-4),调整后见下图。
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4.扩增曲线平台期锯齿状
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1)RNA纯度低,建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。
2)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。


5.扩增曲线杂乱无规律
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可能是ROX浓度和机型不匹配,建议调整ROX浓度,调整后见下图。
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【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE,取消ROX的校正功能,查看扩增曲线是否恢复正常,即可判定是否是ROX导致的。


6.有熔解曲线,无扩增曲线
可能是扩增程序设置错误,未进行荧光信号搜集,建议重新实验,增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。


7.扩增曲线有向上或向下的尖峰
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可能是仪器故障,建议维修仪器。


8. 阴性对照有扩增
1)NTC有扩增,可能有以下两种情况:
①Ct>35,熔解曲线Tm值<80℃(一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上),可能是引物二聚体导致,可进一步优化引物。
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②有Ct值且<35,表示反应体系被污染,可逐步排除污染源。 

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2)NRC有扩增
NTC正常,NRC有Ct值,可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒(如Cat NO.11141ES)。
【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应;NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。


9.复孔重复性差
 
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1)加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
2)模板量低,建议提高模板量,使Ct值落在15-30之间。
3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。


Part2 熔解曲线异常


熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性,理想的熔解曲线为单峰,异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况,下面我们来逐一分析。


1.熔解曲线出现双峰
1)双峰,峰Tm在80℃之前
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①可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。
②可能是模板量过低,促使了引物二聚体的形成,建议提高模板量。
2)双峰,峰Tm在80℃之
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①引物特异性过差导致非特异性产物扩增,建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。
②gDNA污染,可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值,可重新制备模板。


2. 熔解曲线单峰但不尖锐
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可能存在大小相近的非特异性产物,建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。


3.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前
推测未加模板,仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。


4.熔解曲线峰型杂乱
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1)反应体系污染,结合NTC和NRC结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。
2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。
3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。
4)耗材与仪器不匹配,需确认对应仪器对耗材的要求。


5.有扩增曲线,无熔解曲线
可能是熔解程序设置错误,未搜集荧光信号,建议重新实验,增加熔解曲线阶段的信号搜集。


6.两种试剂平行对比,同一产物Tm值不同
可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样,导致同一产物解链温度Tm值不一样。
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7.熔解曲线前端起杂峰
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可能是ROX浓度与机型不匹配,建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常,调整后如下图。
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【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE,取消ROX的校正功能,查看熔解曲线是否恢复正常,即可判定是否是ROX导致的。


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