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第4版自噬研究指南简析

最新版的自噬研究指南(江湖人称Autophagy杂志提升影响因子屡试不爽的终极大杀器),在Autophagy影响因子跌破10的时候终于发布了。在新版指南的加持下,Autophagy重回10+杂志的行列应该不成问题。


言归正传,新版指南近400页,光参考文献就达4000多篇,自噬相关的重要研究成果基本被一网打尽。对于那些希望快速了解自噬领域的研究进展和研究方法的科研汪而言,新版指南是不可多得的佳作,值得一读。


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自噬基本过程


自噬是真核生物特有的依赖于溶酶体的细胞内降解途径。


依据惯例,新版指南在Intorduction部分简要介绍了自噬(指巨自噬)的基本过程,顺便引入了并简介了一些相关概念,如自噬前体(phagophore)、自噬体(autophagosome)、溶酶体(lysosome)和自噬溶酶体(autolysosome)等,让读者对于自噬有一个基本的了解。


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自噬检测方法


想必科研汪们更关心的是怎样入手自噬研究。而自噬检测方法也正是自噬研究指南的重点关照对象。新版指南主要总结了四类检测方案:


1.电镜。自噬体拥有独特的双层膜结构,普通的电镜就可以很容易观察到自噬体。在自噬的早期研究中,电镜是自噬研究为数不多的检测手段;


2.基于LC3/Atg8的检测方案。LC3蛋白发生脂质化修饰(lipidation)之后会由胞质可溶的I型LC3(LC3-I)转变为结合于自噬体膜 的II型LC3(LC3-II或LC3-PE)。根据LC3的这一特性,开发了多种自噬检测手段。如GFP-LC3标记的点状结构指针自噬体的数量, LC3-II蛋白水平指针自噬的降解情况;


3.基于p62/SQSTM1的检测方案。p62作为自噬的重要受体,主要依赖于自噬途径进行降解。因此,p62的蛋白水平也常常用来指针自噬的降解情况。


4.基于其他自噬蛋白的检测方案。自噬途径包含自噬信号启动、自噬前体形成、成熟自噬体形成和自噬体-溶酶体融合等多个步骤。每个步骤都有特异性的自噬蛋白参与其中。因此,很多自噬蛋白通常也被用作自噬不同阶段的分子标记(marker)。如自噬性PI3P的结合蛋白WIPI1/2常常用来标记自噬前体。

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自噬相关药物


另一类大家需要关注的就是种类繁多的自噬相关药物。熟练使用靶向自噬各个阶段的激活剂/抑制剂,对于大家更好地展开自噬研究大有裨益。常用的如mTOR抑制剂rapamycin/Torin1,用来诱导自噬;VPS34复合物的抑制剂3-MA和wortmannin等,用来抑制自噬;溶酶体抑制剂氯奎(chloroquine),用于阻断自噬性降解。




自噬的转录调控


自噬的转录调控主要通过促进自噬相关基因或者溶酶体相关基因的表达实现。目前,参与自噬的转录调控的转录因子最为知名的就是MiT/TFE家族的TFEB蛋白。


此外,FOXO家族的转录因子也被报道参与多个自噬相关基因的转录。除了转录因子,众多表观遗传相关蛋白也可以通过修饰组蛋白调控自噬相关基因的转录。如乙酰转移酶TIPO60通过促进组蛋白H4的乙酰化诱导自噬基因的表达,进而促进自噬。




自噬相关的蛋白翻译后修饰


约40种关键自噬蛋白被鉴定以后,基于它们的各种蛋白翻译后修饰研究就如同雨后春笋一般,层出不穷。


目前,调控自噬途径的主要蛋白翻译后修饰主要分为3类,磷酸化、乙酰化和泛素化。


如蛋白激酶mTOR和AMPK作为主要的自噬上游信号蛋白,通过磷酸化多种自噬蛋白参与调控ULK1复合物和VPS34复合物1的活性,影响自噬的起始;


乙酰转移酶p300/CBP和去乙酰化酶Sirt1通过影响LC3,ATG5和ATG7等自噬蛋白的乙酰化调控LC3的脂质化修饰;


泛素化主要充当自噬性降解的标记,自噬底物(包括蛋白和细胞器)被泛素化后,可以被自噬受体识别并招募至自噬体内,进而通过自噬途径进行降解。


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选择性自噬


近年来,以自噬底物为触发因素诱导的选择性自噬(selective autophagy)受到越来越多的关注。


各种全新的选择性自噬途径被不断发现,除了选择性自噬的资深玩家mitophagy, aggrephagy和xenophagy等,chlorophagy, clockophagy和doryphagy等新型选择性自噬层出不穷。


记得多年前有人开玩笑说,啥都可以被自噬降解,就差细胞核了。没想到一语成谶,多年后还真有研究组发现部分细胞核膜可以由选择性自噬途径之一的nucleophagy介导降解。




分子伴侣介导的自噬


与巨自噬不同,分子伴侣介导的自噬无需形成双层膜结构的自噬体。底物上的特定氨基酸基序被分子伴侣蛋白Hsc70识别后,经由溶酶体定位的LAMP2A直接运送到溶酶体内即可完成降解。




自噬与疾病


自噬与疾病的关系也是自噬领域的一大热点。美国科学家Beth Levine最早就是以Beclin 1为切入点着手研究自噬与癌症的关系。英国科学家David Rubinsztein则是研究自噬与神经退行性疾病的先驱。目前,自噬在癌症和神经退行性疾病的发生发展中的作用依然占据着自噬与疾病领域的半壁江山。


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自噬研究的模式生物


上世纪60年代左右,科学家们主要利用大鼠的肝脏组织并结合电镜技术,进行自噬研究。


差不多到上世纪90年代初,日本科学家大隅良典(2016年诺贝尔生理学或医学奖得主)率先开始利用酵母筛选自噬相关基因,目前已知的大部分自噬基因最早都是通过酵母筛选到的。


大隅良典的高足水岛昇则是利用小鼠在哺乳动物中展开自噬研究的先驱。随着自噬研究的大热,越来越多的模式生物开始进入自噬领域。如中科院生物物理所的张宏研究员利用线虫研究自噬,在领域内独树一帜。另外,利用果蝇、拟南芥、水稻和斑马鱼等研究自噬的也有很多。




自噬研究在线工具


新版指南中还列出了很多可以利用的在线工具,如预测蛋白潜在的LC3结合基序(LIR)的  在线软件http://repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR; 总结自噬相关疾病信息的ATD(autophagy to disease)数据库http://auto2disease.nwsuaflmz.com等等。


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展望


由于自噬过程的复杂性,自噬阻断和自噬激活有的时候会呈现相似的实验结果。如仅仅检测GFP-LC3的点状结构,利用chloroquine阻断自噬流或者利用rapamycin诱导自噬,GFP-LC3的点状结构数量均会显著上升。


因此,仅仅检测GFP-LC3的点状结构还不足以得出可靠的结论。在新版指南的最后,作者也是呼吁自噬研究者尽量采用多种不同的方法检测自噬,以便得出正确的结论。


文章来源:解螺旋;作者:子俞

参考文献

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2020.1797280#_i3


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