PCR污染是每个实验室都多多少少会遇到的问题。PCR是非常灵敏的一项检测，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增，从而容易出现DNA污染导致的假阳性。

PCR污染来源：

试剂污染

主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

环境污染

环境污染的最主要原因是DNA溶液的溅出和DNA气溶胶造成的污染。

1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

污染的监测

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增

防止污染的方法

对于PCR反应液的污染

1. DNase I 法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR。

3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。

4. 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：用dUTP代替dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理新的PCR混合液即可消除旧PCR产物带来的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。

UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键,形成有缺失碱基的DNA链,在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂,从而被消除。UNG酶的最佳活性温度为50C，95℃灭活。

需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响,在进行PCR产物克隆时,应该转化UNG缺陷大肠杆菌受体菌,否转化产物会被受体菌UNG消化掉。

对PCR的环境污染

1. 用常规消毒液定期在环境中喷雾消毒处理。

2. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；其缺点是盐酸对皮肤有一定的腐蚀性。

3. 紫外照射法：紫外波长一般选择254/300nm，照射30分钟至2小时。但需要注意的是，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。

4. 选用商品化的DNA污染祛除剂。

实验操作注意事项

1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

2. 使用一次性吸头，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。

4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。

5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。

6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。

参考：

1.中国疾病预防控制中心病毒预防控制所，《PCR实验室污染原因及解决方法》

2.知乎，胎牛血清，《PCR实验污染的解决办法》

3.唐艳荣，张海云，等。聚合酶链式反应（PCR）中主要污染源及处理方法的分析。农业开发与装备，2017（3）：99-100