最近又遇到的miRNA定量的问题，所以我又把之前的一些内容重新整理了一下，希望能对小伙伴有所帮助。

miRNA的实时定量PCR与普通mRNA的PCR有些不同，这主要是因为 miRNA的自身结构比较特殊。其最大的特点就是长度过于短小，仅仅二十几个碱基的核酸片段无法直接应用常规的 PCR 技术扩增。所以，在针对miRNA的PCR技术中，必须要延长待测miRNA 的长度，构建出一个足够长的PCR模板，才能进一步应用PCR技术 来定量分析。

目前常用的miRNA的定量的方法主要有两种。

颈环法：

茎环法的原理是，设计一种特殊的茎环结构的反转录引物，在反转录反应中直接完成模板链的延长。

反转录引物设计:“茎环”即指反转录引物。茎环结构不但能有效地延长miRNA的长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。整个引物由2部分组成，一个通用的茎环结构和5～8个与目的miRNA的3'端反向互补的碱基。

我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。

颈环结构已经输入，下面查看颈环结构会形成的那些发夹结构。

选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。

第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。

下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU

将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT

miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)

has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT

has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC

颈环引物序列：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3’查看形成的发夹结构（方法前面有讲）

看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：

在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA

查看cDNA结构：

我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。

下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。

首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRNA上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。

为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。

打开File下拉菜单；New；DNASequence。

由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。

复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。

复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。

到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在

primer5.0上进行引物设计。

在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；

点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物；

有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；

自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。

点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；点击OK；

点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序列里结合部位；点击OK确定下游引物；

点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit Primers；

去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不添加序列时的上游引物状况如何。

在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。

绝大多数情况下在前边添加的序列以GC为主，且在加GC序列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。

例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；点击primer；查看引物的长度和TM值差不多了就行。当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG。下游引物不用看了，因为是经典嘛。点击OK。

再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修改，或者更换下游引物。有必要点击比对框下的All查看匹对情况。

加 PolyA 尾法

加尾法的原理则是先对miRNA进行加PolyA尾处理，改造成mRNA的结构，再采用mRNA常用的oligo(dT)反转录引物进行反转录，从而得到较长的模板链。

反转录引物:加尾法的反转录引物实际上就是处理mRNA所用的通用oligo(dT)引物在反转录前有一个步骤是为RNA样品加PolyA尾，然后反转录。所以它的反转录引物中包括:一段通用序列、一段多聚T和一个单碱基锚定。单碱基锚定的概念源于mRNA分析技术中的差异显示(Differential display)技术。其原理是借助mRNA的PolyA尾，对大量的mRNA进行分类。这种在多聚T后加上一个A或C或G的简并反转录引物，能将所有mRNA分类为3种，这就是单碱基锚定。给miRNA加上了PolyA尾后也可以用这种方法，设 计简并反转录引物。例如，5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T)24 V(A\G\C)-3' 5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3'-对应的通用PCR下游引物或5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)12 V(A\G\C)N-3' 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'对应的通用PCR下游引物，V为锚定碱基。也就是说，研究者只需合成这3种反转录引物就足够了。在反转录时，将3种引物一同加入反应体系中，将所有序列反转录。

PCR扩增引物:加尾法的上游引物的设计相对简单，大多数只需直接将目的 miRNA的成熟序列中的U改为T。这时将模板序列上下游引物放到BeaconDesigner7中检验，在上游引物的两端适当地删减几个碱基，调整引物的GC比和Tm值，尽量保证不出现自身二聚体即可。加尾法不用考虑反转录引物与上游引物形成二聚体的问题。以hsa-mir-26a为例，可见上游引物设计只是将所有的U改为T而已，上游引物:5'-TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT-3'，成熟序列:5'-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3'。再以hsa-mir-21为例，不仅改变T外，还在3'端删去了一个A，上游引物:5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'，成熟序列:5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。

两种方法的比较

无论是茎环法还是加尾法，其引物的设计最终要得到“一对半”，“一对”是指PCR扩增的上下游引物，“半”是反转录引物。这3个引物是完成整个实时定量实验所必须的。比较一下2种方法所设计出的引物，不难发现，加尾法的引物设计起来更加容易，当要测定的miRNA种类很多时，加尾 法的优势就更加明显了。在反转录引物上，加尾法应用的差异显示原理简并了3种引物，而茎环法则需要逐一设计相应的反转录引物，随着数量的增加，成本也会拉开差距。在PCR的扩增阶段，虽然两者都有通用的下游引物，但是，由于茎环法特殊的原理，设计上游引物时会比较麻烦，并且在真正的操作中难度还要大，因为目前的软件还不能自动设计超出模板链的引物，需要设计者将模板链与引物序列一同修改，操作繁琐。这一问题的出现，归根结底还是因为miRNA的长度过短所致。miRNA的序列和引物的序列都很短，几个碱基的变化就可能导致整个miRNA或引物的特性的改变，多数miRNA对2种方法都适用，但也有特殊情况。所以在大量检测miRNA时，加 尾法应是首选。另外，由于加尾法的特异性不如茎环法，故茎环法可作加尾法的候补方法，检测那些加尾法效果不理想的miRNA。

内参

除“一对半”的引物之外，实时定量还要设置内参。目前比较常用的是U6。U6是核小RNA，其序列较长，可直接进行扩增，反转录引物就是扩增的下游引物。如:
上游引物 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'
下游引物 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'或者
上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'
下游引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'