今天给大家带来一篇肿瘤免疫相关的5分+干湿结合生信文章。2020年3月发表在“Journal of Pathology”上，题名为“Molecular subtyping reveals immune alterations in IDH wild-type lower-grade diffuse glioma”。全文包含6个Figure和1个Table，接下来我们一起康康免疫相关的生信文章套路是如何应用的吧！
本篇范文研究的主要问题是弥漫性低度胶质瘤(LGG)。与胶质母细胞瘤(GBM, IV级)相比，其病程更为缓慢，且具有高侵袭性。异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)野生型LGGs通常与预后不良有关。在WHO的新分类中，弥漫性LGGs根据IDH突变和1p/19q 共同缺失状态分为三个诊断和预后亚组。IDH野生型肿瘤以高级别(Ⅲ级)为主，预后最差，其次为IDH突变、无1p/19q共同缺失的肿瘤，其次为IDH突变、1p/19q共缺失的肿瘤(少突胶质细胞瘤)。但临床上，IDH野生型LGGs的结果与IDH野生型GBMs的结果难以区分，且比IDH突变型GBMs的预后更差。与此同时，还有研究证明了并非所有IDH野生型LGGs的存活率都很低。目前对IDH野生型LGGs的定义和分型仍有争议。因此，进行进一步分层分析，找到能够划分IDH野生型LGGs预后的标志物是非常有必要的。有很多研究表明在肿瘤微环境中，胶质瘤不同分子亚型间存在差异，其中固有基因表达亚型的进化与微环境的免疫变化相关。且有研究发现具有间充质基因表达特征的GBMs可能对免疫治疗更敏感。目前，神经胶质瘤的免疫治疗受到广泛关注，更好地了解肿瘤免疫微环境对于提高免疫治疗的疗效至关重要。
作者首先在基因表达谱比较的基础上，利用R包“consensus susclusterplus”对从CGGA数据库获得的49个IDH野生型弥漫性LGGs队列中高度可变表达(MAD)> 1的2501个基因进行无监督聚类的亚型鉴定，并以热图的形式展示两个主要亚型(Fig.1A)。接下来，使用R包“princomp”进行主成分分析(PCA)验证这两种亚型的表达谱存在显著差异((Fig.1B)。并分析了这两种亚型聚类的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)，具有显著差异(Fig.1C)。结果显示Sub1患者的临床结果明显较差，Sub2的总体生存期更长。且Sub2中包含更多的II级肿瘤。接下来作者以从TCGA数据库中收集的73个IDH野生型弥漫性LGG表达谱作为验证集，以类似的基因排序再现了CGGA训练集中确定的亚组聚类、PCA以及生存分析验证(Fig.D-F)。作者对IDH野生型弥漫性LGG的两种亚型进行GO及GSEA富集分析以确定差异有统计学意义的基因集(Fig.2A-C)，结果显示，Sub1中高表达基因主要富集于免疫、炎症反应、抗原加工提呈等信号通路，并且该组患者免疫和炎症反应显著增强。为了进一步解释这两种亚型之间的免疫异质性，作者使用“estimate”R包计算基质细胞和免疫细胞的比例，推导每例患者的肿瘤纯度，从而检测各组间基质和免疫内容的分布。以箱线图的形式展示了基质、免疫、纯度、细胞溶解和炎症评分的比较，以及人类白细胞抗原(HLA)基因的表达(Fig.2D-G)。结果表明，Sub1含有更多的免疫细胞。由于天然抗肿瘤免疫需要溶细胞性免疫应答，于是作者通过量化颗粒酶和PRF1的平均表达来计算免疫细胞介导的溶细胞活性，以评估细胞毒性免疫细胞活性。与免疫评分一致，Sub1肿瘤的溶细胞评分明显高于Sub2。进一步，我们计算了肿瘤炎症信号算法，发现Sub1呈阳性。随后为探究微环境中免疫细胞的比例，采用CIBERSORT算法研究了各组间浸润性免疫细胞的组成。发现Sub1中M2巨噬细胞的富集程度较高，而Sub2肿瘤细胞中淋巴细胞、幼稚B细胞和浆细胞的富集程度较高(Fig.2H)。随后在TCGA队列中进行验证，发现具有一致的富集结果及免疫差异（Fig.3）。由于已知T细胞和NK细胞衰竭已被确定为癌细胞逃避宿主免疫的重要机制，作者随后检测了几种明星分子的表达(LAG3、CTLA4、PD1、PD-L1和HAVCR2)。结果发现大部分明星分子在训练集和验证集的Sub1中都有高表达(Fig.S5A,B)，这表明这些肿瘤的免疫衰竭水平升高。并进一步在12例来自CGGA队列的石蜡包埋组织中，针对一些经典标记物进行IHC验证(M2巨噬细胞的CD163；免疫溶细胞活性的GZMA；免疫衰竭的PD1和HAVCR2)。同样，这些基因在sub1中蛋白表达水平较高。总的来说，这些结果在IDH野生型弥漫性LGGs中发现了广泛的免疫异质性。
联&靠——联合免疫细胞标记，分析与IDH野生型弥漫性LGGs预后相关的因素
作者接下来探讨临床意义，分别以溶细胞信号和炎症信号评分对训练集和验证集进行分层预后分析，结果表明炎症评分高与不良预后相关，而细胞溶解活性可能在此肿瘤中不起作用（Fig.4A-B）。另一方面，尽管具有较高的免疫和溶细胞活性，但Sub1中免疫衰竭基因的高表达意味着免疫抑制状态，这可能导致较差的预后。因此，作者接下来以相关性热图展示了炎症和细胞溶解特征与M1、M2巨噬细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞和记忆激活CD4+ T细胞的相关性，以及炎症评分、溶细胞评分和免疫抑制基因(PD-1和CTLA4)之间可能存在相关性(Fig.4C-D)。这些发现提示炎症微环境和浸润性溶细胞性细胞免疫应答可能影响IDH野生型弥漫性低级别瘤变患者的预后。第一步：TCGA队列中Sub1和Sub2之间基因组改变的差异分析作者随后分析了TCGA数据库中的体细胞拷贝数改变（SCNVs）数据，以探讨这两种亚型之间基因组改变的差异。突变特征提供了肿瘤发展的机制，结果发现两组之间在突变频率上没有明显的富集(Fig.5A)。但通过采用GISTIC 2.0分析两组间拷贝数变化则具有显著差异，Sub1显示了更多缺失位点，如CDKN2A/CDKN2B、DMRTA1、C9orf53和MTAP(Fig.5B)。通过上述分层聚类分析，表明以上新的分类方法可能影响疾病预后。于是，作者利用Cox比例风险模型识别预后相关的信号，筛选基于TCGA队列中Sub1和Sub2之间差异基因集。①采用SAM分析鉴定了1453个差异表达基因(FDR<0.05)；②对差异基因进行单变量Cox回归分析，筛选出与生存相关的326个基因（Fig.6A）；③采用Cox风险比例回归模型分析确定具有预后意义的基因，使用“glmnet”R包构建具有最佳预后价值的基因集(Fig.6B)。最终获得5个基因签名，采用基因表达加权回归系数(Coeffs)的线性组合来计算患者的风险得分(Fig.6C)。Ps：这里简单介绍一下“SAM”，是基因芯片著性分析方法的简称，一个由Standford大学开发的免费软件，用来筛选差异基因。其原理是将基因表达数据与临床特征数据关联，可以找到与该特征相关性强的基因，再结合其他方法或数据进一步分析，以揭示共内在的生物学意义。并且SAM软件在筛选得到较多差异基因的同时，FDR值还能够保持在较低的水平，因而是一种非常理想的差异基因筛选工具，有兴趣的小伙伴可以多多尝试哦~根据风险评分的中位数将肿瘤分为低风险组和高风险组。Kaplan-Meier分析显示，高危组患者预后明显差于低危组(P<0.001，Fig.6D)。并在CGGA队列中验证这些基因签名，得到一致的结果(Fig.6F-G)。并且对这些基因签名和病理特征进行联系，以风险评分将患者排序，发现在TCGA集合中按亚型、分级和EM/PM分级分层的病例的分别分析风险评分的分布情况（Fig.6E）。接下来，作者通过单因素和多因素Cox回归分析进一步评估了炎症信号的预后独立性。如预期，获得的基因签名与患者总体生存显著相关，且不受其他因素影响，表明上述分类在IDH野生型弥漫性LGGs中具有预后意义(Table 1)。随后，作者通过计算风险评分、年龄和分组的曲线下面积(AUC)来评估预测准确性。风险评分AUC明显高于其他因素(Fig.6I)。这些结果证明了该特征在预测预后方面的优越性能。
本篇范文中，作者通过分层聚类的方法提出了一种新分类，用于实现基因型和表型的结合，从而把握不同分子特征患者临床转归的同质性，以及胶质瘤诊断的异质性。通过分子病理学诊断弥补传统组织病理学的不足，能够更加精准地反映肿瘤特点。作者采用从CGGA和TCGA获得的122例IDH野生型弥漫性LGGs的转录组数据，将其进行聚类分析，定义了两种具有不同临床和生物学特征的亚型。并将该分类在另一个独立的验证集中重复验证，观察到一致的表型，以证明这个分层具有临床应用价值。进一步的GO和GSEA分析发现，Sub2显著富集于化学突触传递、神经递质和谷氨酸等部分。因有研究表明神经回路中的突触和电整合促进胶质瘤进展，由此提示作者提出的分层在肿瘤进展中具有潜在应用价值。接下来进入重头戏——免疫预后分析。已知侵袭性胶质瘤的特征是基质、免疫评分和细胞溶解活性较高，但纯度较低，通过作者研究发现预后较差的Sub1病例在功能注释上表现出相似的免疫表型，且免疫浸润细胞分析富集于M2巨噬细胞（在胶质瘤中具有原核细胞活性）；而Sub2中表现出幼稚B细胞和浆细胞的高水平浸润（与胶质瘤患者良好预后相关）。同时发现无监督聚类的两个IDH野生型LGGs的稳健亚型，具有不同的预后和免疫特征。随后，作者根据免疫相关评分确定生存预后相关的分子标志物。并进行如Fig.6所示的预后分层分析，证明自己提出的这种分类在不同的治疗策略及预后中具有临床意义，并可能影响IDH野生型弥漫性LGG患者的靶向治疗效果。下面我给大家进行了免疫分子分型类生信文章套路总结：学习过后，我们同样可以将以上生信套路用于分析多种类型的数据，包括临床，SCNAs，基因突变，DNA甲基化和mRNA，miRNA，长非编码RNA和蛋白质的表达等，有待小伙伴们进一步探索发现哦~
