免疫组化实验操作
2022-11-04
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实验干货
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- 免疫组化（ Immunohistochemistry， IHC）
- 棕色越深，目标蛋白含量越高，通过软件分析，即可量化目标蛋白的含量。
- 组织块制备成组织切片。需要用固定液固定组织，常用多聚甲醛、福尔马林、波恩固定液。
- 抗原修复、抗体杂交。固定液中含丰富醛基，能与蛋白质中的氨基交联，从而掩盖一些抗原表位，抗体无法结合，所以在抗体孵育杂交之前要做抗原修复。
- 显色、封片。一抗、二抗杂交完成后，使用 DAB 显色，盖玻片盖片。
◆ 新鲜取材的组织，将组织切成直径不超过 5mm 的小块，4%多聚甲醛 PFA 固定液（PBS 配制，4℃预冷），4℃固定过夜；PBS 洗 3 次，每次 5 min。◆ 组织越新鲜越好，最好一取下就放入预冷的固定液中；如果组织暴露在空气中一段时间，组织缺水，最后组织形态就会不好看。4% PFA 可在适当分装后冻存在-20℃。（最好不要放在 4℃或室温，容易解聚，影响固定效果。固定液推荐用 PFA，最好不用福尔马林）（2）脱水透明 （低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，组织块小的可以缩短脱水时间）③ 70%乙醇，30-60 min（可 4℃过夜）⑥ 100%乙醇，30 min （不要随意增加脱水时间，防止脱水过度）⑧ 二甲苯 透明，10 min × 2 次 (10 min 时更换一次新鲜二甲苯，用二甲苯置换组织中的乙醇，组织会变得透明化。如果前面脱水不充分，二甲苯会变浑浊。)◆ 注意：脱水时，把组织块放中带盖子的玻璃瓶中，在摇床上轻轻摇动，混合液体促进脱水；拧紧盖子，防止乙醇吸收空气中的水分。◆ 梯度酒精可重复使用，按 1ml 乙醇溶液处理一个组织计算，配制 100ml 50%乙醇就可以处理 100 个组织，在试剂瓶上贴标签，画正字做标记，重复使用到差不多次数时就该换新的酒精溶液了。◆ 1mm 的组织块二甲苯透明后会玻璃化；直径大些的组织块，二甲苯透明后，边缘玻璃化，中间雾蒙蒙时就已经算透明完成了，如果持续在二甲苯中待着，组织会变脆，切片时就容易切碎。二甲苯是挥发性液体，强致癌，需要戴口罩，在通风橱中操作。◆ 原理：石蜡中 56℃时可以保持液体状态，把组织放入液体石蜡，让石蜡慢慢渗透进组织间隙；当温度降下来，石蜡凝固， 组织就能在石蜡的支撑下变硬，从而能被切成薄薄的切片，并保持原本的细胞结构。① 石蜡，56℃，2h（省掉了二甲苯和石蜡 1：1，因为高温下二甲苯会让组织更容易变脆）② 石蜡，56℃，2h （浸蜡 2h 后换一道新鲜蜡再浸一次，消除二甲苯的影响）③ 制作包埋块 。使用新鲜化开的头道蜡，把蜡在 56℃融化后搅匀，用玻璃吸管将液体蜡加满金属托（如下图，中），再把浸泡在液体蜡中的组织块放入金属托，用预热的金属镊子调整组织块的切面，盖上塑料盖（作为切片时的样品托），补加蜡液淹没塑料盖，使塑料盖和组织切片形成一个整体（方便样品托要固定在切片机上）。包埋的组织块放室温，自然冷却凝固。为方便脱模，可以放入-20℃冻一会儿（冻久了蜡块容易裂）。① 修块。修出一个组织块在中心的正方型或长方形的切面，四个角尽量是直角，这样切出来的切片正，不容易打卷。② 切片：将蜡块固定在切片机上，切成薄片（5-8um）。切到组织部分时，稍微放慢进刀速度，切好的蜡片会形成一条连续的蜡带，切到一定长度就用毛病拖着轻轻转移到旁边准备好的托盘里（托盘里铺一层黑色的衬底，有种黑色的塑料袋，上面有很多突起，可以很好的隔开蜡片，免得蜡片完全贴中塑料袋上）。③ 展片和贴片：切下的薄片往往皱折，要将之轻轻飘浮在 37℃-42℃热水中 充分展开。转移进托盘的蜡带，可以 2 个组织一组，用手术刀分割一下，然后用镊子轻轻夹到 40℃水浴中展片和贴片，贴片时，载玻片在蜡片旁边竖着插进水里，再竖着提起来，蜡片就能贴在载玻片上。④ 充分干燥：贴片后的载玻片先斜靠着晾干，利用重力赶走蜡片和载玻片之间的水，再收到片盒里，放到 37℃ 恒温箱烤片 3 天。① 脱蜡：60 ℃ 烤 1h （切片上的蜡液融化） → 二甲苯 5 min → 二甲苯 5 min；◆ 切片分别在二甲苯中 2 次以脱掉组织中的石蜡，使组织恢复到固定后的正常状态暴露出抗原以方便与一抗结合。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。脱蜡的效果主要是取决于切片的厚度、二甲苯的温度、脱蜡时间，或移入恒温箱加热脱蜡。② 水化：梯度酒精各 5 分钟（高浓度到低浓度）。无水乙醇 5 min → 无水乙醇 5 min → 95%乙醇 5 min → 85%乙醇 5 min →75%乙醇 5 min → 50%乙醇 5 min；◆ 水化的目的是洗去溶解的石蜡和二甲苯。二甲苯属于非水溶液的有机溶剂，进入组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，需要通过梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替换出来，使标本切片从无水状态顺利进入染色液中进行染色反应。◆ 抗原修复是指暴露抗原被封闭或隐藏的表位，恢复其原有的空间状态，提高抗原阳性检出率的过程。由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。① 非加热修复：酶消化。胰蛋白酶（修复能力较弱，主要用于细胞内抗原的修复，使用 0.1%氯化钙（pH 7.6）制成 0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片 15-30 分钟，陈片应当适当延长时间）、胃蛋白酶（修复能力较强，可用于细胞间抗原的修复）、链霉蛋白酶、蛋白酶 K、皂素。总的来说，非加热修复能力较弱，一些位于细胞间质的抗原可以用酶消化法。② 加热修复（3 选 1）：更推荐加热的修复方式，效果好，且稳定。◆ 煮沸修复（加热修复中效果最弱）：电磁炉煮沸修复液 → 放入切片→ 持续沸腾 15-20 min，自然冷却 。石蜡切片脱蜡至水后，一片片放在耐高温的片夹上，放入盛有修复液的容器（如盛有足够柠檬酸修复液的玻璃烧杯），并将容器放入装满水的电锅里加热煮沸，从沸腾开始计时 15-20min，切断电源，室温冷却，PBS 洗，之后就可以进行免疫组化染色。◆ 微波修复：微波炉煮沸修复液→ 放入切片→ 高火 5 min，冷却 10 min，重复 2-3 次，自然冷却 。微波炉加热煮沸柠檬酸修复液（耐高温的玻璃烧杯盛放修复液），沸腾时，将脱蜡至水的切片放在有机玻璃架上，放入修复液中（也有专用于微波修复的塑料盒，其中装柠檬酸修复液，把切片垂直插在盒中） 。按上述步骤加热修复后（有的抗体不好做，做 3 次加热重复可能会有改善），室温自然冷却，冷却过程中不要把切片从缓冲液中取出。修复完成后，PBS 洗 3 次，再进行后续的免疫组化染色。◆ 高压修复：高压锅煮沸修复液→ 放入切片→ 高压锅开始喷气时计时 1-2 min，冷水冲淋冷却 。切片脱蜡至水后，使用高压锅加热沸腾修复液，将切片放在金属架上，放入沸腾的修复液中（尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆的损伤），高压锅开始喷气时计时 1-2min，关闭加热源，用冷水冲淋高压锅至室温，取下气阀，打开锅盖，取出切片，PBS 洗 3 次，再进行后续的免疫组化染色。◆ 常用的修复方法从强到弱一般分为三种：高压加热修复、微波修复、胰酶修复。其中高压加热修复这一方法简便易操作，效果也更好。有的抗原用一种修复方法可能达不到理想效果，可以考虑酶消化法和高温修复法联用。
（1）灭活内源性过氧化物酶（上抗体之前选做的步骤）：3% H2O2（1ml 30%双氧水 + 9ml 甲醇，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织） ，室温孵育切片 10 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。◆ 在传统的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC 法）和链霉亲和素-过氧化物酶法（SP 法）中，免疫组化反应容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活和封闭。（2）封闭：10%羊血清，湿盒中室温 1h 或 4 ℃ 过夜。（与免疫荧光技术一样，使用 10%与第二抗体同种属的正常血清进行封闭，是为了防止一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性。）（3）一抗孵育：去封闭剂，阻水笔画框将组织片框起来，每个组织上滴加 50ul 抗体，湿盒中 4 ℃ 过夜后，第二天 37 ℃ 1h。吸去一抗，PBS 洗 4 次，每次 5min。◆ 不同的一抗浓度根据抗体说明书而定，孵育时间和温度等对染色结果往往有着较大的影响。在 4℃下，反应缓慢，背景较浅，推荐使用。◆ PBS 洗涤是为了去除未反应的抗体和其他杂物，以减少非特异性反应引起的背景着色和杂物污染，因此应该充分洗涤，特别是一抗孵育后。一般使用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。（4）二抗孵育：加二抗，每个组织上滴加 50ul 抗体，湿盒中 37 ℃ 孵育 30min。吸去二抗，PBS 洗 8-12 次，每次 5min（尽量洗掉非特异的结合）。（1）显色：新鲜配制 DAB 显色液（现配现用），每个组织滴加 50ul，显微镜下控制显色，只上了二抗没上一抗的对照没有出现棕色，而目的组织颜色反应明显时，将片子插到 PBS 里终止显色。◆ DAB 显色液（3,3’-二氨基联苯胺）终产物为棕黄色或棕褐色，为免疫组化最常见的的显色液。DAB 显色的棕黄色色原稳定性好，不溶于有机溶剂，可长期保存而不褪色。背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由 DAB 孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。◆ DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就立即出现很深的棕褐色，这可能说明一抗浓度过高，需要适当下调抗体浓度；若很短时间就出现深背景，有可能非特异性蛋白封闭不全，需要延长封闭时间；DAB 显色时间很长（如超过 10 分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。（2）苏木素复染：显色完毕的片子放入苏木素染液（染细胞核）室温染色（不同牌子的苏木素染色时间不同，见说明书）后自来水冲洗 20-30min，显微镜下随时观察显色情况（够蓝就可以终止了）。（3）脱水：95%乙醇 2-3s → 95%乙醇 2-3s → 100%乙醇 5 min → 二甲苯 : 无水乙醇 1:1 5min → 二甲苯 2min → 二甲苯 2 min。封片技巧：（如图）把准备好的盖玻片正面朝上、反面朝下放着，用小吸管画一长条树胶，然后把染色完毕带有组织的载玻片正面朝下、反面朝上倒扣到盖玻片上。
- 拍照前要注意把显微镜输出图片的格式调成 TIFF 格式，像素尽可能的高。
- 带标尺和不带标尺的照片都要拍摄（各拍一套，有时候软件自带的标尺不好看，作图时按带标尺的照片用 PS 给不带标尺的照片加标尺）
