在研究某个基因或者蛋白A的表达量时,我们往往需要通过Real-time qPCR来验证或者佐证实验结果,从而对基因表达量的Fold change进行评估。Real-time qPCR的关键步骤之一是设计合适的引物,但是如果需要验证的基因过多,这项工作就会变得十分繁琐。因此,在本次专题中,小编将介绍如何批量设计引物。
1.打开含基因ID的原始文件——引物设计原始DNA信息
2.选中Gene id中的所有基因名称,复制
图1
3.打开Tbtools,依次选择Sequence Toolkits;Fasta tools;Fasta Extractor
4.将gene id粘贴到对应位置,并按上图所示将“小麦cDNA库”拖到第一个框,在第二个框设置输出文件(例子中的输出文件名为out.fa)
5.点开始提取序列(如果只需要少量基因,则可以在NCBI查找相关的cDNA序列)
图2
图3
图4
6.打开Primer6软件,点文件夹+导入输出文件out.fa,拖拽选中前10个模板进行引物设计(软件最多可同时设计10个引物)
7.点红蓝箭头设计引物,修改Primer Parameters如图7,点Search,选取任一模板,接第8步
图5
图6
图7
8.点All Primers… ,会出现图8。按照以下规则进行选取。
(1)引物长度一般为15-30bp,常用的为18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;
(2)引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;
(3)Tm值在72℃左右可使复性条件最佳,至少要在55-80℃之间;
(4)引物3’端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高;
(5)引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加;
(6)引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;
(7)产物长度在100-200bp之间,最长不超过300(qPCR适用)。
9.选完以后,单击该引物一栏,待该栏变蓝色后,点Replace即可将该引物设置为最佳引物
图8
10.设计完引物后即可将结果输出,可根据自己需要选择输出引物的信息。点击File出现图9-1所示界面,点Export Primer Result,即可选择输出引物的信息。
图9-1
图9-2
图9-3
相关推荐: