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冰冻切片(组织病理实验)

原理冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间。同时,由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

材料与仪器

新鲜组织

H2O2 酒精 丙酮 PBS DAPI工作液 中性树胶

OCT 速冻架 恒冷箱切片机 烘箱 荧光显微镜

步骤

一、 取材

应尽可能快地采取新鲜的材料,防止组织发生死后变化。

二、速冻

1. 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2 cm)。

2. 如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3. 当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10~20 s组织即迅速冰结成块。

4 在制成冻块后,即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5. 若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三、固定

1. 样品托上涂一层OCT包埋胶,将速冻组织置于其上,4℃冰箱预冷5~10 min 让OCT胶浸透组织。

2. 取下组织置于锡箔或者玻片上,样品托速冻。

3. 组织置于样品托上,其上再添一层OCT胶,以完全覆盖为宜,速冻架(PE)上30 min。

四、切片

1. 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其基本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5~10um。

2. 切片时,低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。

3. 切好室温放置30 min后,入4℃丙酮固定5~10 min,烘箱干燥20 min。PBS洗5 minx3。

4. 进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10 min,消除内源性过氧化物酶的活性。

五、免疫荧光染色

1. 冰冻切片室温晾干15 min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可不洗)。

2. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定,原则是可以均匀覆盖组织面,且保证整个过程中不会使组织干涸)。

3. 将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒,室温孵育2小时或4℃过夜。

5. 第二天先将湿盒放到37℃回温1 h,然后吸取片上的一抗进行回收,将切片插入到小染缸PBS冲洗。

6. 滴加用PBS稀释好的二抗(避光)置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗,切片置于染缸内,PBS洗5 minx3次。

7. 滴加DAPI工作液染核,室温10~20 min(工作浓度0.1%染色15 min)。

8. 回收DAPI,滴加5-10 μl 抗荧光衰减封片剂或中性树胶,用处理干净的盖玻片封片,即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

9. 做好的片放在切片盒内,置于4℃冰箱,可保存一周左右。


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