肿瘤动物模型实验对临床前肿瘤药物开发至关重要。目前已有多种肿瘤模型，其中最简单且应用最广泛的是小鼠皮下移植瘤模型。

皮下荷瘤操作简单方便，肿瘤表浅，便于观察【可以直观观察肿瘤的生长，方便检测动物体重、肿瘤生长曲线、肿瘤重量等重要数据】。皮下荷瘤多采用两种方法：瘤块接种，细胞悬液接种。

做过细胞皮下荷瘤实验的同学可能都遇到过：

（1）同时接种细胞的老鼠长出的皮下瘤大小却差异明显

（2）肿瘤不是过大就是过小，甚至肿瘤串状发生或不成瘤.....

（3）肿瘤长到多大可以结束？

种种问题，最终导致实验结果很差或不能进行。

今天，我们就来介绍一下建立皮下移植瘤模型的关键因素，以提高皮下成瘤的成功率？

一般，移植瘤形成和生长快慢受以下几个方面因素的影响：

（1）肿瘤细胞本身

①首先，细胞株的选择是一个极为重要的问题。一般情况下，并非所有的细胞株都具有较好的成瘤性。你要确定你的细胞能否成瘤，或者说成瘤效果好不好！这个一定要多查查文献

②其次，接种细胞的状态是成瘤实验的关键。细胞状态好，肿瘤易于形成，且生长更快。反之，细胞状态差则不易形成肿瘤或生长缓慢。细胞状态好，1×10⁶细胞可高于状态差的细胞5×10⁶形成肿瘤的能力。

细胞悬液作瘤源时需注意以下几点：（1）取对数生长期细胞，细胞达80-90％左右密度为宜；（2）细胞活率> 90%；（3）酶消化勿过度，肿瘤细胞经酶消化等方式处理后，细胞表面结构遭破坏，发生变化，导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性改变，可影响肿瘤细胞的生长和转移。

③细胞接种量直接关系到最终的成瘤效果。接种细胞数量过少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生长极慢，但接种量过多则可引起肿瘤疯长，这两种情况均不利于实验顺利开展。细胞接种量可以查阅文献确定或者做预实验确认。

为确保细胞数量，实验中需注意以下细节：①计数是否准确，可多次计数然后取均值；②注射器抽吸瘤细胞悬液时是否混匀；③退针后，尽量避免漏液。

（2）接种小鼠

根据实验目的选择小鼠类型（裸鼠、SCID、NOD/SCID、NSG、C57Bl/6和Balb/c），其中C57Bl/6和Balb/c是较常使用的近交系，裸鼠是应用较为广泛的免疫缺陷型小鼠。

①遗传背景和状态

无胸腺裸鼠并非无免疫力，其体内存在较高的NK细胞活力、B细胞活性和非依赖T细胞性免疫活性，它们可能在抵抗移植的肿瘤中起作用。研究发现移植于CBA/N，NSF/N和NIH（S）这3种品系裸鼠的消化道肿瘤快速生长，而其它品系未见此现象，BALB/c-AnN裸鼠体内NK细胞活性比同龄NIH（S）裸鼠NK细胞活性低，故前者移植瘤易发生转移。

②鼠龄和性别

一般选择4-6周裸鼠（体重18-20g左右），小于4周动物可能不耐受而过早死亡，大于6周免疫力会增强，不易成瘤。不少学者报道，在年幼裸鼠（3周龄）体内表现为明显侵袭和高度自发性或实验性转移的肿瘤，在成年鼠（6-8周龄）体内，往往呈局限性生长或低转移。

性别一般雌雄均可，但临床上跟性别相关性大的肿瘤细胞则需要进一步选择老鼠性别，比如乳腺癌细胞选择雌雄，前列腺癌细胞选择雄性。

另外，在开展实验之前，需要提前订购小鼠适应性喂养1-2周，以利于小鼠对周围环境条件改变有相对的适应性。

（3）接种操作

实验员丰富的接种经验极为重要。

①接种前避免激烈震荡细胞，可用移液枪将细胞悬液轻轻地充分吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率。

②接种部位：选择血管丰富且易操作的部位接种，如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位。其中腋下中后部皮下较好，成瘤率高。注意不要注射到腋窝的深部，会影响肿瘤的观察和测量，甚至瘤体可能在生长过程中侵入颈部和胸廓内，引起动物早期死亡。

③接种深度：进针时先用针头刺破皮肤，持平注射器使针头在皮下行进一段距离（约1cm深）后开始注射，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内。（明确针头在皮下后方可注射，绝不可刺破皮肤或者刺破肌肉层。）接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能。

④注射过程中不可使针头移行，注射速度不宜太快。注射结束后缓慢旋转拔出注射器，同时用棉签轻压进针孔处以免有细胞液流出。

⑤接种环节应由一人完成所有动物接种，避免同一实验多人操作。

注意：

（1）细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。

（2）细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成（如果接种量大，可以分批接种）

（3）接种肿瘤细胞时，皮肤不用绷得太紧，平展即可。

（4）其他

①避免裸鼠受伤：接种后特别是成瘤后不宜常调换组间个体，避免生疏个体之间相互嘶咬导致感染而影响瘤体生长，因为裸鼠受伤后导致的炎症会使NK细胞活性升高。当裸鼠出现打架斗殴现象时可进行分笼饲养。

②另外，通过实验动物辐射照射或者注射免疫抑制剂（比如环磷酰胺）可提高肿瘤移植率。

现在我们来看看文章前面的那几个问题

1、肿瘤没有长出来，怎么回事

①肿瘤生长周期很慢，一周开始生长肿块，大约需要1-2个月才能长成肿瘤。

②细胞状态差，活力不好，或肿瘤细胞不易成瘤，需加入Matrigengel辅助或增大接种量或更换细胞系；

③可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞Nude裸鼠）。

2、肿瘤大小不一，体积相差很大？

①并不是所有的肿瘤都能够长得均一形态。对荷瘤小鼠随机分组，排除肿瘤体积过大或过小的荷瘤小鼠。

②也可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致，建议重新接种。

3、肿瘤长起来后又消失了？

肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，长不起来建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠。

4、肿瘤的形状不圆，长条形状?

这是因为接种的手法不到位，接种的时候针头动了，一定要把细胞打完后间歇一会，再缓慢出针。

5、肿瘤长到多大合适？

动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，任何一个维度肿瘤大小不应该超过15mm。

探究与疾病相关的生物标志物动物实验，通常实验周期相对较短，可选用150-250mm³范围的肿瘤；探究药物治疗效果，通常实验周期较长，一般建议使用50-150mm³范围的肿瘤。

考虑动物福利与伦理，必须设置适当的人道终点，当小鼠表现以下症状的任何一种情况时必须终止实验，实行安乐死。表现症状有体重持续下降；小鼠眼睛、耳朵及鼻子器官排泄分泌物；严重腹泻；肿瘤快速增长造成溃烂、坏死或感染。

参考文献：

The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research，doi: 10.1038/s41596-022-00709-3.