今天我们将了解，如何进行培养MSC，培养的过程中需要注意哪些事项？
接下来跟随我们一起做实验吧~
利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。 新生儿脐带 医用手术器械，生物安全柜，CO2培养箱，6孔培养板，T25培养瓶 1. 冻存的MSC NutriStem® XF Supplement在室温或2-8℃解冻，避免反复冻融。 2. 配制：MSC NutriStem® XF Basal Medium（培养基）：MSC NutriStem® XF Supplement（添加物）：青链双抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周内使用。 注1：双抗非必须，建议原代（P0）时使用。 注2：培养基含L-Glutamine，贮藏时避免长期照光。
或跳过此步骤，直接加2%血小板裂解物，促进MSC细胞贴壁与生长。
使用无菌的DPBS，将50X大豆胰酶抑制剂稀释成1X。 注1：抑制重组胰酶消化建议方法： 第一种使用大豆胰酶抑制剂； 第二种使用PBS/DPBS清洗（2倍重组胰酶量）吹打, 离心去上清；第三种使用维持培养基抑制。 无血清培养基抑制胰酶效果较差，使用无血清培养基时建议用第一或者第二种方法抑制/清除胰酶。 1. 无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS漂洗净血迹。 注1：一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。 2. 置10 cm于培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管，用DPBS洗净血迹，再剪成1 mm3组织块。(图1) 3. 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。 4. 37℃，5%CO2培养箱孵育30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。 5. 向每孔滴加0.8 ml 完全培养基（注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块） 。 6. 37℃，5% CO2 培养箱孵育过夜，次日（D1）每孔再补加1 ml 完全培养基。 7. 37℃，5% CO2 继续培养，5天（D6）后半量换液（此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出）。 8. 再过5天后半量换液（此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出）(图2、图3)。 9. 每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞融度（Confluency）达到约80%后传代培养（图4）。 注1：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。 UC-MSC原代培养 （消化法） MSC NutriStem®无血清培养基能有效地培养消化法获得原代细胞，操作方式参考如下： 1. 将脐带用DPBS+1%青链双抗漂洗3~5次，剪成 1-2 cm大小，剔除两根动脉血管和一根静脉血管，获得华通氏胶，同时称重。 2. 将组织块剪成 3-5 mm3，移入50 ml 离心管，再加入相应比例的分离液。 3. 组织块（华通氏胶g）: （分离液vol）= 1:3（1g:3ml），在分离液中添加1%青链双抗。 4. 把 50 ml 离心管横放于 37 ℃细胞培养箱，静置16小时。（若使用旋转法，则置于37 ℃细胞培养箱中旋转4 h，转速为10 rpm。） 5. 消化反应结束之前，预先在6孔板中加入1ml完全培养基（NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold），置于37℃细胞培养箱中孵育1小时，达到预包被的效果。 6. 加入和分离液等体积的0.05%EDTA 终止反应后，将样品转移至15ml离心管中，1200xg 离心5分钟，离心时调至最慢降速（有刹车），去除上清，溶液比较浓稠，小心不要影响下层的细胞；建议留下 2 ml 左右的溶液。 7. 以和分离液等体积的DPBS+1%青链双抗重悬细胞后，500 xg 离心 5 分钟，离心时调至最慢降速（有刹车），小心去除上清，不要影响下层的细胞；建议留下 1.5 ml左右的溶液。重复本步骤操作3次。 8. 用适量的培养基重悬细胞后（重悬后细胞悬液总体积为3 ml），计数细胞密度，即可按常规细胞培养方法接种原代细胞培养。（原代细胞推荐用NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold培养） 注：消化后的原代细胞，建议培养时接种密度提高10000/cm2以上；传代后即可按常规的接种密度（5000~6000/cm2）培养。 UC-MSC传代培养与冻存
